重组干酪乳杆菌分泌表达猪轮状病毒VP4蛋白和VP4-LTB融合蛋白及其免疫效果分析

论文摘要

猪轮状病毒（Porcine Rotavirus, PRV）属于呼肠孤病毒科轮状病毒属,是引起仔猪病毒性腹泻的主要病原之一。该病是典型的粪—-口传染,针对其黏膜感染特点,研制有效的刺激黏膜免疫系统产生局部免疫应答,进一步引起全身性系统免疫反应的疫苗,对该病的防治具有重要意义。LTB为大肠杆菌不耐热肠毒素的结合亚单位,无毒素活性,可以与多种蛋白抗原或非蛋白抗原经不同免疫途径共同免疫机体,可增强机体的系统免疫及黏膜免疫应答,同时,还能消除机体对免疫原的耐受,诱发长期免疫记忆。本研究以猪轮状病毒感染与免疫特点和乳酸菌的肠道益生作用、佐剂效应、非特异性抗菌、抗感染特点,设计利用干酪乳杆菌Lactobacillus casei ATCC 393（L.casei 393）作为递呈抗原的活菌载体,以VP4（猪轮状病毒的主要保护性抗原）和VP4-LTB（VP4与大肠杆菌不耐热肠毒素的B亚单位相连接）为目的基因,插入到分泌表达型的乳酸杆菌中,构建表达了猪轮状病毒主要免疫保护性抗原VP4的重组干酪乳杆菌表达系统和共表达VP4-LTB的重组干酪乳杆菌表达系统,分析比较了这两种重组干酪乳杆菌的免疫原性。以猪轮状病毒VP4基因的前756bp的质粒VP4-pGEX-6P-1为模板,根据表达载体融合表达位点及干酪乳杆菌密码子使用的偏嗜性,应用oligo6.0软件设计引物P1-P2,经PCR扩增出约756bp的目的基因VP4,将VP4基因片段克隆到pMD18-T simple载体,并进行了酶切、PCR鉴定和序列测定,重组质粒命名为pMD18-T-VP4。重组质粒经BamHI和XhoI双酶切,回收目的基因片段VP4与经同样双酶切的表达载体pPG-2连接,电转化感受态L.casei 393,筛选阳性克隆,并进行酶切、PCR和测序鉴定,重组质粒命名pPG-2-VP4,重组干酪乳杆菌命名为pPG-2-VP4/L.casei393。同时,以质粒pMD18-T-LTB为模板,以同样方法设计引物P3-P4,扩增出约375bp的目的基因LTB,再将LTB进行SalI和XhoI双酶切,回收的目的基因片段LTB与经过XhoI单切的质粒pMD18-T-VP4连接,用引物P1-P4扩增出目的片段VP4-LTB,再将其与pMD18-T simple载体链接,并进行酶切、PCR鉴定和序列测定筛选出阳性质粒命名为pMD18-T-VP4-LTB,重组质粒经BamHI和XhoI双酶切后电转化L.casei 393,鉴定后重组质粒命名pPG-2-VP4-LTB,重组干酪乳杆菌命名为pPG-2- VP4-LTB /L.casei393。将获得的两种重组干酪乳杆菌以2%乳糖为诱导剂进行目的蛋白的诱导表达。重组干酪乳杆菌经诱导后的SDS-PAGE检测结果表明,有约27kD和40kD的融合蛋白得到了表达,表达蛋白的大小与理论值相符。Western blot结果分析表明,表达的蛋白可被PRV抗血清所识别,间接免疫荧光实验结果表明,所表达的蛋白能够在干酪乳杆菌菌体表面检测到;为了证明两株重组干酪乳杆菌系统作为活菌疫苗潜在的应用价值,以及LTB的粘膜免疫作用,本实验以BALB/c小鼠为试验动物,进行免疫学实验。免疫程序为:实验鼠口服接种109活菌量,每隔2w免疫一次,共免疫三次,每次连续免疫3d,一天免疫一次。同时,以口服空载体干酪乳杆菌为阴性对照。免疫后分别测定了小鼠粪便、阴道粘液、泪液、乳汁样品中抗VP4分泌型IgA及小鼠血清样本中抗VP4的特异性IgG水平。ELISA检测结果表明,口服免疫重组干酪乳杆菌后在小鼠粪便、阴道黏液、泪液、乳汁中均检测到了特异性sIgA,而且VP4-LTB共表达菌株在诱导sIgA抗体水平和持续时间都明显优于单独表达VP4的重组菌。但共表达菌株和单独重组菌的血清样本检测结果表明,虽然二者均能诱导产生较高IgG抗体,但抗体水平无明显差别。通过脾细胞增殖实验及IL-4、IFN-r的测定结果表明,所构建的重组干酪乳杆菌表达系统可诱导明显的细胞免疫应答。采用病毒中和实验检测针对猪轮状病毒免疫保护性抗原VP4产生抗体的病毒中和能力。结果表明重组菌pPG-2-VP4/L.casei393血清抗体中和效价为1:99。重组干酪乳杆菌pPG-2-VP4-LTB /L.casei393血清抗体中和效价为1:199。以重组菌作为口服疫苗获得了较好的免疫效果,实验结果充分说明所构建的重组干酪乳杆菌表达系统作为口服疫苗具有潜在的应用价值,为猪轮状病毒疫苗的研制提供了依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 研究的目的和意义
• 1.2 轮状病毒研究进展
• 1.2.1 轮状病毒的形态学
• 1.2.2 轮状病毒的不同抗原类型和特性
• 1.2.3 轮状病毒的基因组结构特征
• 1.2.4 轮状病毒蛋白质及其功能
• 1.2.5 VP4 基因研究进展
• 1.2.6 轮状病毒免疫保护机制的研究
• 1.2.7 轮状病毒疫苗研究进展
• 1.3 大肠杆菌不耐热肠毒素（LT）研究进展
• 1.3.1 LT 的结构与性质
• 1.3.2 LT 的功能
• 1.3.3 B 亚基介导的免疫调节作用
• 1.4 乳酸菌作为口服疫苗传递异源抗原活载体的研究进展
• 1.4.1 乳酸菌的益生作用
• 1.4.2 乳酸杆菌作为黏膜免疫活载体疫苗的特征
• 1.4.3 重组乳酸菌作为活载体疫苗的研究现状
• 2 材料与方法
• 2.1 表达PRV-VP4 与PRV-VP4-LTB 蛋白重组干酪乳杆菌的构建
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 重组干酪乳杆菌的诱导及表达蛋白的鉴定
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 口服重组干酪乳杆菌免疫学指标的测定
• 2.3.1 实验材料
• 2.3.2 实验方法
• 2.4 重组干酪乳杆菌口服免疫小鼠后对脾细胞增殖的影响
• 2.4.1 免疫后小鼠脾细胞增殖的测定
• 2.4.2 免疫后细胞因子IL-４、IFN-r 的测定
• 2.5 抗体中和活性检测
• 2.5.1 实验材料
• 2.5.2 实验方法
• 3 实验结果
• 3.1 目的基因的PCR 扩增结果
• 3.2 重组质粒PMD18-T-VP4 的鉴定结果
• 3.3 重组质粒PMD18-T-VP4-LTB 的鉴定结果
• 3.4 表达载体的鉴定结果
• 3.5 重组表达载体PPG-2-VP4、PPG-2-VP4-LTB 的鉴定
• 3.6 重组干酪乳杆菌的诱导及表达蛋白的鉴定
• 3.6.1 目的蛋白的诱导表达
• 3.6.2 目的蛋白分泌性表达的鉴定结果
• 3.6.3 间接免疫荧光鉴定结果
• 3.7 重组菌口服免疫小鼠特异性抗体的检测结果
• 3.7.1 小鼠粪便中特异性sIgA 检测结果
• 3.7.2 小鼠血清中特异性IgG 抗体检测结果
• 3.7.3 免疫小鼠眼洗液、阴道洗液中特异性sIgA 测定结果
• 3.7.4 小鼠乳汁特异性抗体sIgA 测定结果
• 3.7.5 小鼠粪便中特异性抗体sIgA 变化趋势的检测结果
• 3.8 重组干酪乳杆菌口服免疫小鼠后对脾细胞增殖的影响结果
• 3.8.1 免疫后小鼠脾细胞增殖的测定结果
• 3.8.2 免疫后细胞因子IL-４、IFN-r 的测定结果
• 3.9 抗体中和效价的检测结果
• 4 讨论
• 4.1 依据猪轮状病毒感染的特点设计乳酸菌口服疫苗可行性分析
• 4.2 VP4 抗原的选择与免疫效果的分析
• 4.3 外源蛋白表达后在菌体中的定位
• 4.4 口服免疫后引起的局部和系统免疫应答的效果分析
• 4.5 口服免疫重组乳酸菌后引起的细胞免疫应答
• 4.6 LTB 的共表达与免疫效果分析
• 4.7 重组菌免疫动物后抗体中和活性分析
• 4.8 小结
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文