论文摘要
背景骨质疏松是一种以骨量减少和骨微结构破坏为特征,导致骨脆性增加和易于骨折的代谢性疾病。随着骨质疏松患者不断增多,研究如何有效预防和治疗骨质疏松具有非常重要的临床价值。原林教授提出的“筋膜学假说”认为人体是由尚未分化的非特异性结缔组织（筋膜）支架构成的支持与储备系统和被该支架支持与包绕的已分化为各种功能细胞构成的功能系统共同组成。功能系统是建立在各种功能细胞的专能特化的基础上,而支持与储备系统是以筋膜支架中未分化的干细胞为核心。支持与储备系统中未分化干细胞通过分化为各种定向干细胞,能够为功能系统中各种功能细胞的更新提供源源不断的细胞源泉,并为功能系统中各种功能细胞的代谢提供营养物质,维持内环境的稳定。因此,功能系统只有在支持与储备系统的支持下才能维持结构和功能的稳定,而一旦某种功能细胞在代谢过程中不能及时得到新细胞的补充,机体就会出现相应的病变。骨质疏松正是由于骨组织吸收后,筋膜支架中未分化的干细胞未能充分向成骨细胞分化骨形成不足而致的一种疾病。因此,当骨代谢过程中出现负平衡后,如何有效增加筋膜支架中尚未分化的干细胞,使成骨细胞得到有效的补充促进骨形成重建正平衡是治疗骨质疏松的关键。脂肪组织是支持与储备系统中重要组成部分,其中分离出的脂肪源干细胞（adipose-derived stem cells, ADSCs）是筋膜支架中未分化干细胞的一种重要储备形式。目前脂肪源干细胞的研究已成为干细胞研究的热点之一。研究表明,脂肪源干细胞易分离培养；具有多种分化潜能,甚至能够跨胚层分化,在特定的环境中可以诱导向成骨、成软骨、成脂、成肌和成神经等分化；具有低免疫原性和免疫调节功能。此外,与目前研究较多的骨髓间充质干细胞相比,脂肪源干细胞来源更加广泛,获得更加容易,并且给病人带来的创伤和痛苦更小。这些特征均为脂肪源干细胞的异体移植提供了有利条件。因此,通过增加机体未分化的脂肪源干细胞,促进其向成骨分化,增加骨形成可能会对骨质疏松起到预防和治疗作用。利用糖皮质激素建立骨质疏松模型已成为比较成熟的模型。长期给予大剂量的糖皮质激素可以通过引起体内钙磷代谢的紊乱,甲状旁腺素分泌增加,骨保护素分泌减少,成骨细胞增殖和活性受到抑制而破骨细胞数量和活性增加等多种途径使骨吸收增加,骨形成减少,最终导致骨质疏松。为了探讨异体脂肪源干细胞移植对骨质疏松的预防和治疗作用,本实验通过观察移植异体脂肪源干细胞对糖皮质激素致骨质疏松大鼠钙磷代谢、骨密度、骨生物力学及骨组织形态计量学等方面的影响进行综合评价,探索一种新的骨质疏松治疗方法,为临床骨质疏松的预防和治疗提供新的研究思路。目的1、分离培养脂肪源干细胞并对其多向分化能力和表面标志进行鉴定,以判断支持与储备系统中是否含有未分化的脂肪源干细胞;2、通过骨密度检测判断长期给予糖皮质激素建立骨质疏松模型是否成功；3、通过血清钙、磷、碱性磷酸酶检测,观察异体脂肪源干细胞对糖皮质激素致骨质疏松大鼠骨钙磷代谢和骨形成的影响；4、通过对骨密度的检测观察异体脂肪源干细胞对糖皮质激素致骨质疏松大鼠骨质量的影响；5、通过三点弯曲试验观察异体脂肪源干细胞对糖皮质激素致骨质疏松大鼠骨强度和骨刚度的影响；6、通过骨组织形态计量学观察观察异体脂肪源干细胞对糖皮质激素致骨质疏松大鼠骨组织微环境的影响；7、为“筋膜学假说”中“通过动员支持与储备系统中未分化干细胞可以治疗退行性和衰老性疾病”提供部分实验依据。方法1、取成年大鼠腹股沟皮下脂肪垫,胶原酶消化分离培养筋膜结缔组织中脂肪源干细胞。传至第6代时,分别通过形态学、成脂成骨诱导分化及利用流式细胞术对表面抗原CDllb、CD29、CD45、CD49d、CD90和CD106进行鉴定,判断所培养的细胞是否为具有多向分化潜能的脂肪源干细胞。2、40只Wistar雌性大鼠随机分成空白对照组（A组）、模型组（B组）、治疗组（C）和治疗对照组（D组）。B、C和D组分别给予颈背部皮下注射醋酸泼尼松龙注射液8mg/kg,3次/周；A组分别给予颈背部皮下注射生理盐水0.8mL,3次/周。12周后,将A组和B组处死取材,判断造模是否成功。3、待模型建立成功后,收集传至第6代的脂肪源干细胞,经尾静脉向C组大鼠每只注射脂肪源干细胞3×106个,D组大鼠每只注射生理盐水1mL,4周后处死取材。4、水合氯醛麻醉大鼠后,心脏取血促凝管接取,室温下放置8h后3000r/min,离心15min制备血清,-70℃分装保存。用全自动生化分析仪分别利用偶氮砷Ⅲ法、磷钼酸比色法和速率法测定血清中钙、磷和碱性磷酸酶的含量。取血完毕后,心脏放血处死,分别取出大鼠第三至第五腰椎和双侧股骨,去除周围肌肉组织。腰椎和右侧股骨利用双能X线骨密度仪小动物测量软件测定骨密度值。左侧股骨利用BOSE生物材料动态力学试验机进行三点弯曲实验,股骨背侧向上,腹侧向下,跨距为18mm,速率为0.05mm/s,股骨压断时记录最大载荷和刚度值。5、处死后取出右侧胫骨上1/3部分,手术刀片矢状面剖开,固定后酒精逐级脱水,分别浸入浸液Ⅰ（甲基丙烯酸甲酯70mL+邻苯二甲酸二丁酯30mL）、浸液Ⅱ（浸液Ⅰ+过氧化苯甲酰1g）和浸液Ⅲ（浸液Ⅰ+过氧化苯甲酰2.5g）各2d,再用新鲜配制的浸液Ⅲ进行包埋。Jung K重型切骨机连续切取6μm厚度切片,分别进行组织学观察（Gemisa染色）和类骨质观察（von Kossa染色）。测量区域为生长板下1mm至4mm范围内,采用Lecia QWin多功能彩色病理图像分析软件进行骨组织形态计量学分析。具体参数包括骨小梁相对体积（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁分离度（Tb.Sp）和单位骨小梁破骨细胞数（OC.N）,均采用国际通用的公式进行计算。结果1、经光学显微镜观察,原代培养的ADSCs24h后大部分可贴壁,细胞呈圆形、多边形或者梭形。细胞长势良好,7d后可按1：3传代,之后每3d可传代一次。经换液传代至第6代,可见细胞形态均一,呈纺锤形或者多角形。体外诱导可以向成脂、成骨分化。流式细胞术检测发现CD29和CD90呈强阳性,CD106呈弱阳性,CD11b、CD45和CD49d呈阴性。2、长期大剂量给予糖皮质激素后,与空白对照组比较,模型组大鼠血清钙和碱性磷酸酶水平、骨密度、骨强度和骨刚度均显著降低,而血清磷水平显著上升（P<0.05）；骨小梁变细、变薄,骨小梁排列紊乱,骨小梁间出现断裂,间距增大,出现陷窝；骨小梁的数量、相对体积和厚度均显著降低,而骨小梁的分离度增高,单位骨小梁破骨细胞数增多（P<0.05）。3、异体移植脂肪源干细胞后,与模型组比较,治疗组大鼠血清钙和碱性磷酸酶水平、骨密度、骨强度和骨刚度均显著增加,而血清磷水平显著降低（P<0.05）；骨小梁数目增多,骨小梁变厚变粗,骨小梁间出现连接,陷窝减少；骨小梁的数量、相当体积和厚度显著增加,而骨小梁分离度显著降低,单位骨小梁破骨细胞数减少（P<0.05）。结论1、支持与储备系统中含有脂肪源干细胞,并且这种干细胞是一种未分化的间充质干细胞；2、长期给予大剂量的糖皮质激素可以建立骨质疏松模型；3、通过异体脂肪源干细胞移植可以有效改善体内钙磷代谢,增加骨形成,有效预防和治疗骨质疏松,为临床上骨质疏松的研究和治疗提供了一种新的研究思路和方法；4、对“筋膜学假说”中“通过动员筋膜结缔组织中储备的未分化干细胞可以治疗退行性疾病”提供了部分实验依据。综上所述,移植异体脂肪源干细胞对糖皮质激素致骨质疏松大鼠有一定的治疗作用,能够促进骨形成,增加骨密度,改善骨生物力学性能,增强骨强度,降低骨折发生率。本实验进一步提示在骨质疏松的研究中应该更加关注提高机体干细胞的数量和促进干细胞向成骨细胞分化及骨组织的形成方面,为临床上治疗骨质疏松提供了一种新的研究思路。
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