论文摘要
目前人们对纤维素酶的研究多以葡聚糖内切酶为主,而葡萄糖外切酶是纤维素水解酶系中唯一可以作用于结晶纤维素的酶组分,其中CBHⅡ基因对整个纤维素酶系的表达起着重要作用。同时大量证据显示低pH值通过阻止瘤胃内纤维水解细/真菌生长,进而抑制瘤胃纤维消化（细/真菌生长要求的最低pH值为5.9）,难以建立起稳定的工程菌。通过遗传工程对耐受低pH值的瘤胃细菌引入纤维水解功能,可能是增强酸性条件下纤维水解能力的有效途径。纤维素酶的分子生物学与基因工程研究发展将会加快纤维素酶广泛应用于工农业生产的进程,为人类解决能源危机、粮食短缺、环境污染等难题都具有现实意义。本试验就通过转基因技术将得到的CBHⅡ基因工程菌,在大肠杆菌和乳酸杆菌中进行表达并对其活性进行了检测。首先,以限制性内切酶SmaⅠ和SphⅠ双酶切含有酸性纤维素酶基因的已知重组质粒pMD18-T-CBHⅡ和非抗生素抗性穿梭质粒表达载体pW425t,胶回收CBHⅡ基因片段和载体pW425t目的大片段并用T4 DNA连接酶连接目的片段,即是将纯化的CBHⅡ基因亚克隆至穿梭质粒表达载体pW425t中,对所获得的重组质粒进行核苷酸序列测定,经测序验证CBHⅡ基因的核苷酸序列与GeneBank中发表的核苷酸序列的同源性达到99.79%并且其连接无误,这样就构建出可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425t-CBHⅡ。其次,将重组质粒pW425t-CBHⅡ分别用CaCl2方法和电击转化方法转化至thyA基因缺陷型的大肠杆菌及乳酸杆菌受体菌感受态细胞中,再进行培养和挑选阳性转化子。第三,将转化子在培养基上扩增培养后,通过质粒提取、酶切、PCR鉴定以及生长功能弥补筛选阳性克隆,经1%琼脂糖凝胶电泳结果表明CBHⅡ基因已经整合入大肠杆菌中和乳酸杆菌中PCR产物的分子量约为1.4kb。最后,将确定已经存在阳性转化子的阳性菌株经SDS-PAGE分析,在大肠杆菌和乳酸杆菌种进行表达均可见约49.6kd的目的蛋白。经刚果红染色显示,大肠杆菌转基因工程菌和乳酸杆菌转基因工程菌两种工程菌与对照组相比均可产生明显的水解圈,这充分说明所构建的转酸性纤维素酶基因工程大肠杆菌和乳酸杆菌都具有分泌酸性纤维素酶的功能;并且采用CMC法和pNPC法测得在温度50℃,pH 5.0时两种基因工程菌的酶活力达到最大。