论文摘要
MADS-box基因是一类广泛存在于植物中的同源异型基因,在生物体不同的组织以及生长发育的不同阶段都存在MADS-box基因的表达,它属于一个古老的基因家族,是植物生长发育过程中重要的调控因子。目前对MADS-box基因调控机理的研究已成为植物分子生物学领域中的一大热点。矮牵牛PMADS9基因是MADS-box基因AGL15亚家族的成员,该亚家族基因可能具有调控开花时间、抑制花器官衰老脱落和促进体胚形成等功能。通过RACR技术和YADE法,我们分别从矮牵牛小花蕾RNA和叶片DNA基因组中克隆得到了PMADS9基因的编码区（GenBank登录号：DQ418547）和5’端翻译起始位点（ATG）上游1053bp的启动子序列（GenBank登录号：FJ798977）。然后在两端设计引物,利用PCR技术从基因组DNA中扩增得到了全长基因序列共5861bp（GenBank登录号为EU338501）。RACE分析发现该基因至少有4个转录起始位点（TSS）,2个位于编码区第一外显子内。本研究,继续克隆了PMADS9基因上游未知的启动子区域,获得了更长的800bp序列,并对该启动子的功能进行了初步地研究,这对于进一步了解PMADS9基因表达调控的特点,以及更深入研究矮牵牛花器官发育的分子机理都有着重要的意义。本文所取得的主要实验结论如下：1.在已获1053bp启动子序列的基础上,利用hiTAIL-PCR技术对矮牵牛PMADS9基因上游未知启动子序列进行了再扩增,获得了更长的800bp启动子片段,用SeqMan软件对新获取的序列与原有1053bp序列进行了拼接,最终获得了PMADS9基因全长启动子序列1853bp。2.运用PLACE和PlantCare等在线分析软件对该序列进行了预测分析,该启动子除了具有TATA-box和CAAT-box等基本转录元件外,还富含花粉和种子发育过程中特异表达所需的调控元件,以及与环境应答相关的各种顺式调控元件。FootPrinter分析表明,AGL15同源基因启动子之间存在非常保守的RY-repeat元件,启动子的保守性与物种的遗传距离不一致；推测PMADS9基因翻译起始位点（ATG）上游200～400bp和800～1000bp区域具有重要的功能。3.应用PCR技术对启动子序列进行5’缺失；用各缺失片段替换表达载体pCAMBIA1305.1中的CaMV35S组成型启动子序列,与GUS报告基因连接,成功构建了所有缺失重组表达载pCAMBIA1305.1空载为阳性对照,转化矮牵牛V1。GUS染色与PCR鉴定表明,成功实现了各表达载体对矮牵牛的稳定遗传转化,获得了阳性转基因植株。4.待移栽后的转基因植株开花后,对其进行GUS组织化学染色分析,结果表明全长启动子序列（1853bp）转化后的阳性植株,在茎、营养叶、苞叶以及花萼中几乎检测不到GUS活性；GUS基因在雄蕊、雌蕊、子房中有较高的表达丰度,在花瓣中也有一定丰度的表达,这与之前PMADS9基因表达分析的结果基本一致。在转基因植株内,各缺失表达载体的表达模式无明显差异,最短的启动子缺失片段（298bp）就能启动报告基因在转基因植物体内表达,说明其已具备启动子所需的各种基本调控元件。
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相关论文文献
- [1].矮牵牛PMADS9基因启动子的克隆及分析[J]. 植物遗传资源学报 2011(02)
- [2].矮牵牛PMADS9基因的结构特征和mRNA的表达分析[J]. 园艺学报 2011(01)