论文摘要
DNA在紫外线诱导下会产生损伤，这种损伤会导致生物体生长迟缓、诱发突变甚至死亡。DNA光修复酶（photolyase，EC 4．1．99．3）可以吸收300-500nm的光子的能量来修复这种损伤。大肠杆菌photolyase含有两个辅基，分别为黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和次甲基四氢叶酸（MTHF）。FAD为活性催化所必需，其生理状态是还原态（FADH-）的。MTHF则具有吸收传递能量的作用。 本文研究了DNA光修复酶（photolyase）的纯化、发酵和活性检测，并对其细胞和鼠体活性进行了初步研究。 第一章 photolyase的表达和纯化 E.coli phr基因构建到表达质粒pET-22b（+）中，获得pET-22b（+）∷phr（N+X），该质粒表达的目的蛋白为C末端偶联有6×His-tag的融合蛋白。BL21（DE3）／pET-22b（+）∷phr（N+X）经IPTG诱导表达，可表达近20％菌体总蛋白量的目的蛋白，其中约1／3为可溶性蛋白。利用Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow一步亲和层析进行纯化，可以获得近95％电泳纯的photolyase。UV-Vis扫描和荧光扫描结果表明E.coli photolyase具有两个辅基，为MTHF和FADH。 第二章 BL21（DE3）／pET22b（+）∷phr的补料发酵 在10L BioFloⅣ发酵罐中利用补料分批培养技术发酵表达含重组质粒pET-22b（+）∷phr（N+X）的BL21（DE3）大肠杆菌，批量生产photolyase。在发酵过程中，尽量控制充足的溶氧量，温度37℃，在基础培养基内生长12h后，加终浓度1mmol／L IPTG于30℃诱导表达目的蛋白，4h后补加以甘油为碳源的补料，继续培养6小时，收集菌体。22h小时发酵结束后，菌体密度最终达40g／L，纯化所得蛋白约占总菌液的42mg/L。 第三章 cis-syn thymine-thymine CPD oligonucleotide的制备及利用反相高效液
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