铜矿废弃地优势植物根际土壤细菌多样性及铜抗性菌株强化植物富集铜作用的研究

论文摘要

土壤重金属污染植物修复技术具有绿色廉价、操作简单等优点,但是超积累植物往往生物量低、生长速度慢,现有的强化植物修复的物理化学等方法又存在修复成本高,环境风险大等缺点。因此寻求一条能够大幅度提高植物修复效率,并且环境友好的微生物强化植物修复途径,将具有重要的理论意义和现实意义。本研究首先对铜矿废弃地重金属耐性优势植物根际土壤中的细菌多样性进行了分析。DGGE结果显示植物根际土壤中的重金属抗性细菌存在着丰富的多样性,但不同植物根际微生物区系差异不明显,相似性均在87%以上,从DGGE图谱上也可以看出共有条带占大多数。结合传统的微生物平板分离技术从11种铜耐性植物根际土壤中分离筛选到89株可以在含Cu 50 mg·L-1的平板上生长的细菌,逐步提高Cu浓度并进行铜活化试验,筛选到17株既能抗Cu(200 mg·L-1)又能活化铜的细菌。对这17株细菌进行16S rDNA序列分析,结果显示了它们丰富的遗传多样性。摇瓶条件下的铜活化试验结果显示了它们的功能多样性。ACC脱氨酶活性、铁载体、IAA等促生特性测定试验显示了它们的代谢多样性。17株细菌对温度、pH、盐浓度的耐受性以及对其他重金属离子和抗生素的抗性也都表现出丰富的多样性。综合考虑,在17株铜抗性细菌中选择生长速度快,产酸多,铜活化效果好,抵抗外界不良环境因素能力强,具有促生能力的4株:JYC17、MT16、YAH27和HQN2为供试菌株进行研究。摇瓶条件下供试菌株对培养液中碱式碳酸铜和氢氧化铜的活化试验表明,菌株不仅能耐受铜,而且能够通过自身代谢产酸使沉淀态铜活化。菌株JYC17、MT16、YAH27和HQN2能使含碱式碳酸铜和氢氧化铜的有氮改良培养液的pH值比对照降低2.29-3.04个单位和0.19-2.64个单位,有效态Cu含量比对照增加136%-402%和103%-218%。测定菌株JYC17、MT16、YAH27和HQN2培养液中低分子量有机酸发现,不同菌株产生的有机酸的种类和含量各不相同,并且,铜的存在能够促进菌株有机酸的合成。在土壤活化试验中,菌株HQN2的活化能力最强,YAH27次之。培养10 d,接菌土壤中细菌数量为106-107cfu·g-1土。由于土壤体系强的缓冲能力,接菌土壤的pH值与对照相比仅有略微下降。采用三亲本杂交的方法成功地对铜抗性细菌JYC17、MT16、YAH27和HQN2进行了gfp基因标记,获得标记菌株JYC17-gfp、MT16-gfp、YAH27-gfp和HQN2-gfp。研究表明,gfp在标记菌株JYC17-gfp、MT16-gfp、YAH27-gfp和HQN2-gfp中稳定性良好,且不影响菌株活化重金属铜的性能。定殖试验表明,标记菌株JYC17-gfp、MT16-gfp、YAH27-gfp和HQN2-gfp虽然不能进入玉米根内部定殖,但可以在根表面定殖,并可以促进玉米苗期的生长。盆栽试验表明,接种菌JYC17-gfp、MT16-gfp、YAH27-gfp和HQN2-gfp都能够在一定程度上促进玉米的生长从而使植株生物量增加。其中,菌株JYC17-gfp对玉米的促生效果最好,既能够显著提高玉米地上部的生物量（增加了23.0%）,又可以显著提高玉米根部的生物量（增加了14.7%）。接菌处理玉米根际土壤中有效态铜含量明显增高,玉米植株富集重金属铜的量也随之增加,与对照相比,玉米地上部铜浓度分别增加了26.7%-63.3%,根部铜浓度分别增加了25.6%-45.2%。玉米吸收的铜多集中在根部,难于向地上部转移,转运系数均小于1,接菌处理有助于Cu2+向玉米地上部转移。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号及缩略语说明
• 引言
• 第一章 文献综述
• 第一节 矿区土壤重金属污染的现状及其危害
• 1 矿区废弃地现状
• 2 矿区重金属污染
• 3 重金属污染的危害性
• 第二节 矿区土壤重金属污染的修复措施
• 1 工程治理措施
• 2 物理修复措施
• 3 化学修复措施
• 4 农业修复措施
• 5 生物修复措施
• 5.1 微生物修复
• 5.2 植物修复
• 5.3 植物-微生物联合修复
• 第三节 植物根际细菌的多样性及其在联合修复中的作用
• 1 植物根际细菌的多样性
• 1.1 物种多样性
• 1.2 遗传多样性
• 1.3 代谢多样性
• 1.4 生态多样性
• 2 微生物在联合修复中的作用
• 2.1 影响植物根际重金属的活性
• 2.2 促进植物的生长
• 2.3 改善植物营养
• 2.4 提高植物抗病能力
• 第四节 研究的目的和意义
• 第二章 铜矿废弃地重金属耐性优势植物根际土壤细菌多样性研究
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果与分析
• 3.1 土壤样品分析
• 3.2 植物样品分析
• 3.3 植物根际土壤与非根际土壤中可培养细菌数量的比较
• 3.4 不同植物根际微生物群落DGGE分析
• 3.5 铜抗性细菌的分离
• 3.6 铜抗性细菌的鉴定
• 3.6.1 菌株的形态学特征
• 3.6.2 菌株的生理生化特征
• 3.6.3 菌株的16S rDNA序列分析
• 3.7 环境条件对菌株生长的影响
• 3.8 供试菌株对其他重金属的抗性
• 3.9 供试菌株对抗生素的抗性
• 3.10 供试菌株的促生性能
• 4 讨论
• 5 本章小结
• 第三章 铜抗性细菌对铜的活化作用研究
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果与分析
• 3.1 供试菌株活化培养液中碱式碳酸铜
• 3.2 供试菌株活化培养液中氢氧化铜
• 3.3 培养液中有机酸的测定
• 3.4 供试菌株活化土壤中碱式碳酸铜
• 3.5 供试菌株活化土壤中氢氧化铜
• 3.6 供试菌株活化铜污染土壤中不溶性铜
• 4 讨论
• 5 本章小结
• 第四章 铜抗性细菌gfp基因标记及其在玉米根际的定殖
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果与分析
• 3.1 三亲本杂交与接合子的鉴定
• 3.2 出发菌株与gfp标记菌株菌落形态比较
• 3.3 质粒遗传稳定性检测
• 3.4 铜活化试验
• 3.4.1 摇瓶条件下菌株对铜的活化效果
• 3.4.2 菌株对土壤中铜的活化效果
• 3.5 标记菌株在玉米根表定殖的观察
• 3.6 标记菌株在玉米根表面定殖密度的测定
• 4 讨论
• 5 本章小结
• 第五章 铜抗性细菌强化植物富集铜的研究
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果与分析
• 3.1 菌株对玉米生物量的影响
• 3.2 菌株对玉米富集铜的影响
• 3.3 标记菌株在玉米根表定殖的观察
• 3.4 不同处理玉米根际土壤中可培养细菌数量的比较
• 3.5 不同处理对玉米根际土中有效态铜含量的影响
• 3.6 不同处理对玉米根际土壤酶活性的影响
• 3.7 不同处理对玉米根际土中pH的影响
• 4 讨论
• 5 本章小结
• 全文总结
• 参考文献
• 附表
• 致谢