论文摘要
研究背景及目的：世卫组织的统计数据显示,目前全球平均每8个死亡病例中就有1人死于癌症,无论在发达国家还是发展中国家,癌症都是导致人们死亡的主要“杀手”之一。尽管现代医疗水平不断提高,癌症患者预后却仍很不令人满意。至今,对恶性肿瘤的治疗仍以手术、放疗、化疗等方法为主。因此,人们在积极努力地寻找新的更加有效的抗肿瘤方法。随着分子生物学的发展和对肿瘤分子机制认识的深入,现在人们已意识到恶性肿瘤是一种多因子、多步骤和多基因参与的全身性疾病。因此,在这近10年中,肿瘤的生物治疗和基因治疗一直是肿瘤治疗研究的热点和新希望。间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）是干细胞的一种,因能分化为间质组织而得名,具有亚全能分化潜能,在特定的体内外环境下,能够诱导分化成多种组织细胞。因此,MSCs被广泛应用在细胞治疗和组织再生方面的研究。在实验中应用的人间充质干细胞（human Mesenchymal Stem Cells, hMSCs）主要来自成人骨髓。近来,hMSCs与肿瘤关系的研究已成为热点。一方面,研究发现hMSCs具有肿瘤趋向性,携带抗肿瘤细胞因子基因的hMSCs在实验动物体内能够靶向迁移,进入肿瘤组织,产生抗肿瘤因子,抑制肿瘤生长。因此,hMSCs亦被看作最有前途的肿瘤基因治疗的靶基因细胞载体。另一方面,有些研究认为hMSCs有促进肿瘤生长的作用,而另有研究报道hMSCs能够抑制肿瘤的发生和发展。因此,关于hMSCs对肿瘤的作用,到目前没有得出一致的结论。这可能与之相关的研究较少有关,尤其缺乏hMSCs对肿瘤细胞在体外和体内作用的系统研究。为了进一步了解hMSCs与肿瘤的关系,探讨hMSCs在肿瘤防治中的应用价值,我们以肺癌细胞株A549和食管癌细胞株Eca-109为代表,研究了hMSCs对肿瘤细胞在体外增殖、凋亡和侵袭作用的影响及其分子机制,并通过建立BALB/c裸鼠移植瘤模型观察hMSCs对肿瘤细胞在体内生长的作用。并以此探索hMSCs在有恶性肿瘤存在的情况下,其应用的安全性。现将本项研究的主要内容简要介绍如下。第一部分人间充质干细胞对肿瘤细胞A549和Eca-109增殖、凋亡和侵袭影响的体外研究[方法]人间充质干细胞及其培养液购自美国Cyagen公司；人肺癌细胞株A549和食管癌细胞株Eca-109购自上海SIBCB。首先收集hMSCs条件培养液,在-80°C下储存以备用。然后分别采用transwell共同培养系统和hMSCs条件培养液处理A549和Eca-109,应用细胞计数法计数处理后的肿瘤细胞,观察hMSCs对肿瘤细胞A549和Eca-109体外增殖的影响。采用流式细胞术Caspase-3酶活性分析法检测经hMSCs条件培养液处理的A549和Eca-109细胞的细胞周期和凋亡情况；采用transwell侵袭实验,检测hMSCs在体外对肿瘤细胞A549和Eca-109侵袭能力的影响。Western Blotting检测PCNA, Cyclin D1, Cyclin E, pRb, phospho-pRb, P27, Bcl-2, Bcl-xL, Bax, MMP-2等蛋白表达,及免疫沉淀法检测Cyclin E-CDK2激酶活性,以探索hMSCs在体外对肿瘤细胞作用的分子机制。[结果]1.在体外,共同培养或用hMSCs条件培养液处理均显示hMSCs对肿瘤细胞A549和Eca-109的增殖有显著的抑制作用,且细胞周期分析显示肿瘤细胞被阻滞于细胞周期的G1期。2.流式凋亡检测和Caspase-3酶活性分析均显示,hMSCs在体外促进肿瘤细胞A549和Eca-109的凋亡。3Transwell侵袭实验结果显示,hMSCs在体外抑制肿瘤细胞A549和Eca-109的侵袭能力。4. Western Blotting检测和免疫沉淀结果显示,在hMSCs条件培养液的作用下,A549和Eca-109细胞的PCNA, Cyclin E, phospho-pRb, Bcl-2, Bcl-xL, MMP-2等蛋白表达下调,Cyclin E-CDK2复合物合成减少。[结论]在体外,人间充质干细胞（hMSCs）抑制肿瘤细胞A549和Eca-109的增殖,促进肿瘤细胞凋亡,并抑制肿瘤细胞的侵袭能力。其作用机制可能是hMSCs通过分泌某些细胞因子作用于肿瘤细胞,进而调控细胞PCNA, Cyclin E, phospho-pRb, Bcl-2, Bcl-xL,MMP-2等相关基因的表达,实现对肿瘤细胞增殖和侵袭能力的抑制作用。第二部分人间充质干细胞对肿瘤细胞A549和Eca-109生长作用的体内研究[方法]采用6周龄BALB/c裸鼠,将肿瘤细胞和hMSCs备成单细胞悬液（5×106 Eca-109或A549/0.1ml PBS）或制成混合细胞悬液（5×106Eca-109或A549细胞和1×106hMSCs/0.1ml PBS）注射于裸鼠背部皮下,建立动物移植瘤模型。每5天测量并记录小鼠的成瘤情况及肿瘤体积。实验结束时,处死小鼠,取肿瘤组织固定于10%的福尔马林溶液,采用CD34免疫组化结果评估肿瘤微血管密度（MVD）,以探索hMSCs在体内对肿瘤生长作用的机制。[结果]在体内,hMSCs和A549（或Eca-109）被共同注射组小鼠的成瘤率和平均肿瘤体积明显高于单纯注射肿瘤细胞组。说明hMSCs在体内促进肿瘤形成和生长。通过CD34免疫组化进行小鼠肿瘤微血管密度（MVD）检测,结果显示,共同注射组小鼠肿瘤的MVD明显高于对照组。且在处死小鼠后,肿肿瘤组织时,我们发现在共同注射组小鼠肿瘤表面分配有更丰富的血管。这些结果说明hMSCs在体内促进肿瘤形成和生长,其机制与hMSCs在肿瘤微环境中促进肿瘤血管形成有关。[结论]在体内,人间充质干细胞能够促进肿瘤形成和生长。其机制可能与hMSCs在肿瘤微环境中促进肿瘤血管形成有关。全文总结为了明确人间充质干细胞（hMSCs）对肿瘤细胞生长的作用,我们首先研究了hMSCs对肺癌细胞株A549和食管癌细胞株Eca-109在体外增殖、凋亡和侵袭的影响。我们发现,在体外,hMSCs抑制肿瘤细胞A549和Eca-109的增殖,并诱导其细胞周期停滞于G1期；促进肿瘤细胞A549和Eca-109的凋亡；并抑制A549和Eca-109细胞的侵袭能力。Western blotting和免疫沉淀结果显示,hMSCs在体外对肿瘤细胞所显示出的抑制作用与hMSCs分泌某些活性因子诱导肿瘤细胞的PCNA. Cyclin E、Cyclin E-CDK2、phospho-pRb、Bcl-2、Bcl-xL和MMP-2等蛋白表达水平下调有关。然而,动物实验结果与体外实验结果相反,在hMSCs和肿瘤细胞共同移植入裸鼠皮下后,我们发现hMSCs在体内促进了肿瘤的形成和生长。hMSCs促进肿瘤血管形成是其机制之一。已有文献报道,hMSCs在肿瘤微环境中能够分化为成纤维细胞和内皮样细胞,而这些细胞可直接或间接参与并促进肿瘤间质及肿瘤血管的形成。因此,hMSCs对肿瘤细胞在体内和体外所展示的不同的作用可能与其自身的分化能力有关。我们目前的研究结果提示人间充质干细胞对肿瘤细胞有双重作用：体外抑制增殖,体内促进生长。在体外,hMSCs对肿瘤细胞的抑制作用为探索hMSCs在肿瘤防治中的研究价值提供了理论依据。同时,鉴于hMSCs在体内具有促进肿瘤生长的作用,我们建议,在涉及恶性肿瘤的情况下,探索hMSCs的细胞治疗和组织再生等用途时应慎重。