肉桂地链霉菌接合转移体系的构建及nsdA基因中断对莫能菌素产量的影响

论文摘要

接合转移作为基因转移工具已在多种链霉菌中成功应用，此方法既可以避开胞外核酸酶使DNA免遭降解，在一定程度上还可以克服宿主对外源DNA的限制性修饰提高转化效率，目前，肉桂地链霉菌（Streptomyces cinnamonensis）的体内遗传操作主要通过原生质体来完成，本研究率先探索了大肠杆菌-肉桂地链霉菌接合转移系统，利用大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒，转化ET12567（pUZ8002），然后接合转移肉桂地链霉菌BIB2005，优化接合转移条件。获得了较好的转化效果。nsdA基因（negative regulator of streptomyces differentiation）是一个在链霉菌基因组中广泛存在的全局性负调控因子，基因序列保守。迄今为止，nsdA基因改造在工业菌株中的应用还没有相关的报道，本研究率先在肉桂地链霉菌的工业菌株中开展了nsdA的基因中断工作。本研究利用生物信息学分析基因组已知的阿维链霉菌、天蓝色链霉菌nsdA及相邻序列，设计通用引物P1，P2，在肉桂地链霉菌BIB2005总DNA中扩增nsdA同源基因及其两侧序列的4.8kb的片段并测序验证。合成一对长度分别为58，59nt的引物，其5’端的39nt序列分别与nsdA基因两侧同源，3’端则分别与安普霉素抗性标记盒（aac（3）Ⅳ+oriT）两侧序列一致。以该引物扩增的PCR产物电转化表达λRed重组酶且含有目标质粒的Escherichia．coli菌株BW25113／pIJ790／pBIB118，获得了阳性重组质粒pBIB929，再接合转移至肉桂地链霉菌BIB2005，筛选得到表型为AprRKanS的接合子BIB309。PCR验证nsdA基因已被正确中断。与出发工业菌株相比，中断株在形态上较出发菌株发生了较大的变化，在摇瓶水平上nsdA中断突变株BIB309莫能菌素产能提高了2.7倍。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语
• 第一章 前言
• 1.聚醚类抗生素
• 1.1 简介
• 1.2 聚醚类抗生素的作用机理和化学合成
• 1.3 聚醚类抗生素的产生菌
• 2.莫能菌素
• 2.1 莫能菌素的化学结构及性质
• 2.2 莫能菌素的生物合成
• 2.3 莫能菌素分子生物学研究进展
• 2.3.1 概述
• 2.3.2 莫能菌素的前体合成
• 2.3.3 ccr（丁烯酰辅酶A还原酶基因）
• 2.3.4 meaA（甲基丙二酰CoA基因）,icm（异丁酰辅酶A的异构酶基因）
• 2.3.5 monBⅠ,monBⅡ（异构酶基因）
• 2.3.6 monH,monRⅠ,monRⅡ（转录调节基因）
• 3.抗生素合成的调控
• 3.1 途径专一性调控
• 3.2 抗生素合成的全局调控
• 3.3 双组份调控
• 3.4 nsdA基因简介
• 3.5 本课题立题依据及意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 质粒
• 2.1.3 PCR引物
• 2.1.4 培养基和生化试剂
• 2.1.5 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌种培养及保藏
• 2.2.2 大肠杆菌质粒DNA的小量提取（碱裂解法）
• 2.2.3 大肠杆菌感受态的制备及质粒的热激转化
• 2.2.4 大肠杆菌质粒DNA的少量快速提取及检测
• 2.2.5 链霉菌总DNA的少量快速提取
• 2.2.6 PCR
• 2.2.7 DNA片段的回收
• 2.2.8 载体的去磷酸化
• 2.2.9 DNA连接
• 2.2.10 PCR介导的定向基因置换技术
• 2.2.11 大肠杆菌与链霉菌之间的属间孢子接合转移
• 2.2.12 发酵培养
• 2.2.13 菌体浓度的测定
• 2.2.14 莫能菌素效价的测定
• 第三章 结果与分析
• 3.1 大肠杆菌-肉桂地链霉菌BIB2005接合转移系统的建立和优化
• 3.1.1 大肠杆菌—肉桂地链霉菌BIB2005属间接合转移,本研究尝试了以下方法
• 3.2 基因中断和基因置换的基本原理
• 3.3 PCR介导的基因中断和基因置换的基本原理
• 3.4 nsdA基因中断载体的构建
• 3.4.1 肉桂地链霉菌负调控基因nsdA的检测。
• 3.4.2 PCR克隆nsdA及两侧基因
• 3.4.3 肉桂地链霉菌nsdA基因序列分析
• 3.4.4 PCR扩增两侧与nsdA基因同源的抗性标记
• 3.5 nsdA基因置换载体的构建
• 3.5.1 将PCR回收产物装载在AT载体,构建pBIB906
• 3.5.2 重新构建置换载体
• 3.5.3 筛选转化子
• 3.5.4 重组质粒的PCR验证
• 3.5.5 pBIB929通过接合转移导入肉桂地链霉菌。
• 3.6 筛选双交换菌株
• 3.6.1 筛选
• 3.7 nsdA基因中断的PCR验证
• 3.8 nsdA基因中断菌株的生物表型
• 3.9 nsdA中断株发酵分析
• 第四章 总结与讨论
• 4.1 总结
• 4.1.1 构建并优化了大肠杆菌-肉桂地链霉菌接合转移系统
• 4.1.2 首次克隆了肉桂地链霉菌nsdA基因,并完成nsdA全基因组测序。
• 4.1.3 肉桂地链霉菌nsdA基因的中断。
• 4.2 讨论
• 4.2.1 关于接合转移体系的构建
• 4.2.2 关于基因中断载体的构建
• 4.2.3 关于电转化
• 4.2.4 关于nsdA基因的中断
• 4.3 展望
• 参考文献
• 致谢