时间分辨荧光免疫检测技术在鳗鲡养殖病原菌检测中的应用

论文摘要

近年来,我国水产养殖业迅速发展,养殖规模不断扩大,但在目前高密度的集约化养殖生产过程中,病害频繁发生,尤以细菌病最为严重,每年给国家造成极大的经济损失。因此建立灵敏、特异、快速的病原菌检测技术,对水产养殖病害防治无疑能起到积极的指导作用。时间分辨荧光免疫检测技术（TRFIA）是一种非放射性免疫分析技术,其灵敏度高、特异性好、操作简便。但在水产养殖病原菌检测中从未见报道,本研究首次利用TRFIA技术对鳗鲡养殖病原菌的检测开展了系统研究。主要内容如下:1.建立了直接TRFIA法检测产酸克雷伯氏菌B12,分析了颗粒性抗原对时间分辨荧光的影响,通过对测量时间、微孔板的优化,最终检测灵敏度为1.0×105 cfu/m L,灵敏度与酶联免疫吸附法（ELISA）相当。这说明TRFIA同样适用于颗粒性抗原的检测,且检测灵敏度存在很大的可拓展空间。2.建立了间接TRFIA法检测嗜水气单胞菌B18。此法的检测灵敏度较直接法提高了10倍,为1.0×104cfu/m L,同时避免了对特异性抗体的标记。3.通过对免疫时间及包被Ig G、Eu3+-Ig G的优化,建立了日本鳗鲡产酸克雷伯氏菌的双抗夹心型TRFIA法,同时从精密度、灵敏度、特异性等参数上进行评估。该法检出限为5.0×103cfu/m L,标准曲线在5.0×103-1.0×107cfu/m L范围内线性良好,相关系数达0.99以上,均优于目前常用的荧光抗体法及ELISA法。且特异性好,重复性好、可用于实际样品检测。4.将生物素-链霉亲和素系统引入TRFIA用于检测嗜水气单胞菌B27,进一步提高检测灵敏度,同时从精密度、灵敏度、特异性和稳定性等参数上进行评估。标准曲线在1.0×102-1.0×106 cfu/m L范围内线性良好,该方法的灵敏度为1.0×102 cfu/m L,优于双抗体夹心时间分辨免疫检测法。且特异性好,重复性好,有效期为六个月以上,可用于实际样品检测。5.应用合成的稀土螯合物进行了TRFIA检测病原菌的初步尝试,与商品化的试剂相比,螯合物本身就具有荧光,不需要解离增强,简化了步骤,同时降低了成本,是今后开展TRFIA研究的一个发展方向。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 主要符号表
• 第1章 引言
• 1.1 水产养殖病原菌检测技术研究现状
• 1.1.1 传统检测技术
• 1.1.2 免疫检测技术
• 1.1.3 分子生物学技术
• 1.2 TRFIA在食品化学污染物检测中的应用
• 1.2.1 TRFIA在农药检测中的应用
• 1.2.2 TRFIA在兽药检测中的应用
• 1.2.3 TRFIA在生物毒素检测中的应用
• 1.3 本研究的意义、内容和技术路线
• 1.3.1 研究意义
• 1.3.2 研究内容
• 1.3.3 技术路线
• 第2章 直接TRFIA检测产酸克雷伯氏菌B12
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试剂和材料
• 2.1.2 实验仪器
• 2.1.3 主要试剂配制
• 2.2 实验方法
• 3+标记及纯化'>2.2.1 IgG的Eu³⁺标记及纯化
• 3+-IgG的标记比计算'>2.2.2 Eu³⁺-IgG的标记比计算
• 2.2.3 直接TRFIA法的建立
• 3+-IgG最适工作浓度的确定'>2.2.4 Eu³⁺-IgG最适工作浓度的确定
• 2.2.5 重复性实验
• 2.2.6 特异性实验
• 2.2.7 敏感性实验
• 2.2.8 TRFIA检测法的实际应用
• 2.3 结果与分析
• 3+-IgG的纯化结果'>2.3.1 Eu³⁺-IgG的纯化结果
• 3+-IgG的最适工作浓度'>2.3.2 Eu³⁺-IgG的最适工作浓度
• 2.3.3 增强液解离时间的优化
• 2.3.4 微孔板的影响
• 2.3.5 敏感性测定
• 2.3.6 特异性测定
• 2.3.7 重复性实验
• 2.3.8 日本鳗鲡样品TRFIA检测
• 2.4 小结
• 第3章 间接TRFIA检测嗜水气单胞菌B18
• 3.1 材料与方法
• 3.2 实验方法
• 3+标记及纯化'>3.2.1 羊抗兔IgG的Eu³⁺标记及纯化
• 3+-IgG的标记比计算'>3.2.2 Eu³⁺-IgG的标记比计算
• 3.2.3 间接TRFIA法的建立
• 3.2.4 兔抗血清最适工作浓度的确定
• 3+-IgG最适工作浓度的确定'>3.2.5 Eu³⁺-IgG最适工作浓度的确定
• 3.2.6 敏感性实验
• 3.3 结果与分析
• 3+-IgG的纯化结果'>3.3.1 Eu³⁺-IgG的纯化结果
• 3.3.2 兔抗血清的最适工作浓度
• 3+-IgG最适工作浓度的确定'>3.3.3 Eu³⁺-IgG最适工作浓度的确定
• 3.3.4 敏感性测定
• 3.4 小结
• 第4章 双抗夹心TRFIA检测产酸克雷伯氏菌B12
• 4.1 材料与方法
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 改良的间接ELISA步骤
• 4.2.2 双抗夹心TRFIA法的建立
• 4.2.3 包被IgG的最适工作浓度的确定
• 3+-IgG最适稀释度的确定'>4.2.4 Eu³⁺-IgG最适稀释度的确定
• 4.2.5 最佳免疫反应时间的确定
• 4.2.6 重复性实验
• 4.2.7 特异性实验
• 4.2.8 敏感性实验
• 4.2.9 TRFIA检测法的实际应用
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 包被IgG的最适工作浓度的确定
• 3+-IgG的最适工作浓度'>4.3.2 Eu³⁺-IgG的最适工作浓度
• 4.3.3 最佳免疫反应时间的优化
• 4.3.4 重复性实验
• 4.3.5 特异性测定
• 4.3.6 敏感性测定
• 4.3.7 日本鳗鲡样品TRFIA检测
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第5章 BA-TRFIA检测嗜水气单胞菌B27
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 试剂和材料
• 5.1.2 实验仪器
• 5.1.3 主要试剂配制
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 IgG的亲和纯化
• 5.2.2 IgG的分析与鉴定
• 5.2.3 IgG的生物素标记
• 5.2.4 BA-TRFIA的建立
• 5.2.5 生物素化IgG最适工作浓度的确定
• 5.2.6 重复性实验
• 5.2.7 特异性实验
• 5.2.8 敏感性实验
• 5.2.9 稳定性试验
• 5.2.10 TRFIA检测法的实际应用
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 IgG的纯化及分析鉴定结果
• 5.3.2 生物素化IgG的标记比计算
• 5.3.3 生物素化IgG的最适工作浓度
• 5.3.4 重复性实验
• 5.3.5 特异性测定
• 5.3.6 稳定性分析
• 5.3.7 敏感性分析
• 5.3.8 美洲鳗鲡样品TRFIA检测
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 第6章 应用新型螯合物TRFIA法检测嗜水气单胞菌B27的初步研究
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 试剂和材料
• 6.1.2 实验仪器
• 6.1.3 主要试剂配制
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 螯合物DTPA-pAS的合成
• 6.2.2 螯合物DTPA-pAS的时间分辨荧光性能检测
• 6.2.3 DTPA-pAS-IgG的合成
• 6.2.4 免疫测定
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 DTPA-pAS的结构示意图和紫外光谱分析
• 6.3.2 DTPA-pAS-Tb的时间分辨荧光最小检测限
• 6.3.3 DTPA-pAS在IgG上的标记
• 6.3.4 免疫检测
• 6.4 讨论
• 6.5 小结
• 第7章 结论与展望
• 致谢
• 参考文献
• 在学期间发表的学术论文