展示生长抑素的猪细小病毒样颗粒构建及其免疫效力研究

论文摘要

猪细小病毒（Procine parvovirus, PPV）是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一,给世界养猪业造成巨大的经济损失。VP2是其主要衣壳蛋白,约占衣壳蛋白总量的80%,可诱导保护性中和抗体。VP2蛋白体外表达时可自主装配成完整的病毒样颗粒,同时也是构建多价疫苗的良好载体。生长抑素（somatostatin, SS）是下丘脑释放的14肽激素,具有抑制生长激素的分泌的生理功能。生长抑素免疫动物产生抗体,通过中和SS进而提高生长激素水平促进动物生长。本文以猪细小病毒VP2蛋白为载体,在其N端插入4拷贝生长抑素,用杆状病毒表达系统获得自我装配的病毒样颗粒,试图获得既可预防猪细小病毒病又能促进生长的嵌合疫苗。主要研究内容如下：1重组生长抑素的猪细小病毒VP2基因在昆虫细胞中的表达及鉴定以PPV NJ-a株为模板扩增VP2基因片段,人工合成4拷贝生长抑素基因,克隆至杆状病毒载体pFast-HT A,获得重组质粒pFast-SS4-VP2。转化DH10Bac感受态细胞,蓝白斑筛选三次后鉴定获取阳性重组Bacmid。Bacmid转染sf-9细胞,出现病变后收毒鉴定,得到rBac-SS4-VP2。SDS-PAGE与Western-blot可见约68kDa的rSS4-VP2条带；rBac-SS4-VP2感染细胞IFA检测产生很强的特异性绿色荧光；感染细胞超薄切片电镜观察到大量特征性病毒样颗粒。2杆状病毒表达SS4-VP2重组蛋白纯化免疫原性初步鉴定4周龄清洁级小鼠80只随机分为9组：SS4-VP2/白油、SS4-VP2/铝胶、SS4-VP2/IMS、SS4-VP2/铝胶+CpG、SS4-VP2/IMS +CpG、rBacmid-SS4-VP2/铝胶+CpG、PPV NJ-a灭活苗组、野生型杆状病毒组和PBS组。重组蛋白的免疫剂量为50μg/只,杆状病毒及猪细小病毒灭活疫苗免疫剂量为5×105TCID50/只,共免疫3次,免疫间隔2周。ELISA试剂盒检测猪细小病毒抗体结果表明,重组蛋白组与PPV NJ-a灭活苗组均产生特异性抗体,SS4-VP2/铝胶组抗体水平最高,SS4-VP2/白油组最低,阴性对照组没检测到特异性抗体；利用PK-15细胞检测PPV特异性中和抗体水平,中和抗体的滴度与ELISA检测效价正相关,SS4-VP2/铝胶组中和抗体效价最高；重组蛋白免疫组均产生较高滴度的抗生长抑素抗体,同时,生长激素水平提高了1倍左右。3猪细小病毒多抗的的制备利用PK-15细胞大量增殖猪细小病毒NJ-a株,通过PEG-NaCl方法浓缩、纯化PPV,获得高纯度PPV抗原。将获得的PPV抗原分别用以弗氏佐剂,不完全弗氏佐剂乳化,3次免疫家兔,每次免疫间隔两周,制备得到兔抗PPV特异性多克隆抗体。Western-blotting,间接免疫荧光均证明该多克隆抗体能与杆状病毒表达的VP2蛋白发生特异性反应。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词表
• 第一篇 文献综述
• 第一章 猪细小病毒研究进展
• 1 猪细小病毒的病原学
• 2 猪细小病毒的基因结构
• 3 PPV转录的调控
• 4 PPV的血凝性
• 5 猪细小病毒的流行病学及致病机理
• 6 临床症状及病理变化
• 7 猪细小病毒疫苗研究进展
• 参考文献
• 第二章 生长抑素研究进展
• 1 SS结构
• 2 SS作用机制
• 3 SS影响动物生长的生理功能
• 4 动物生长抑素的调控研究
• 5 生长抑素的应用
• 参考文献
• 第三章 杆状病毒/昆虫细胞表达系统研究进展
• 1 杆状病毒的基本特性
• 2 杆状病毒的基因组结构
• 3 杆状病毒的感染周期及形态结构
• 4 Bac-to-Bac表达系统
• 5 Bac-to-Bac系统蛋白表达特点
• 6 影响杆状病毒系统表达外源基因产物的因素
• 7 杆状病毒/昆虫细胞表达系统的应用与前景
• 参考文献
• 第二篇 试验研究
• 第四章 展示生长抑素的猪细小病毒样颗粒的制备及鉴定
• 1 主要材料与试剂
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第五章 展示生长抑素的猪细小病毒样颗粒的免疫原性评价
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第六章 猪细小病毒特异性多克隆抗体的制备与鉴定
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 致谢