论文摘要
背景和目的肺癌是当今世界上严重威胁人类生命与健康的最常见的恶性肿瘤之一,已成为各种恶性肿瘤死亡的首要原因。据统计,在欧美国家和我国大城市中,肺癌的发病率已居男性各种肿瘤的首位,肺癌总的5年生存率低于15%,其主要原因是大部分肺癌患者确诊时已为进展期,丧失了有效的手术治疗时机。目前肺癌发生的确切分子机制尚未充分阐明,因此了解肺癌的形成、发展及转移的分子机制,对其诊断和防治具有重要的理论意义和实用价值。肿瘤的侵袭和转移是恶性肿瘤死亡的主要原因之一,但肿瘤侵袭和转移的途径和机制尚有许多不明之处有待探讨。乙酰肝素酶（heparanase, HPSE）是1999年Vlodavsky等克隆出来的一种内糖苷酶,可降解细胞外基质和基底膜中的硫酸乙酰肝素（heparansulfate, HS）。最近研究发现,HPSE在多种人类恶性肿瘤中高表达,具有促进肿瘤细胞侵袭和转移的重要作用,并且与肿瘤新生血管的形成具有密切关系。本研究通过免疫组织化学法检测]HPSE在人非小细胞肺癌组织中的表达,探讨HPSE的表达水平与患者临床病理特征及预后的关系；在体外实验中分别检测乙酰肝素酶反义寡核苷酸（heparanase antisense oligodeoxynucleotide,HPSE ASODN）对人肺癌A549细胞HPSE mRNA和蛋白表达的影响,运用MTT法和侵袭实验探讨HPSE ASODN对A549细胞生长和侵袭力的抑制作用。通过裸鼠人肺癌A549细胞皮下移植瘤模型,探讨HPSE ASODN对人肺癌A549细胞裸鼠皮下移植瘤的抑制作用。方法应用免疫组化法检测HPSE蛋白在52例非小细胞肺癌组织中的表达,结合患者的临床病理学特征及预后进行分析。设计合成互补于HPSE mRNA起始密码区的HPSE ASODN,实验分ASODN组、脂质体组和对照组三组,以阳离子脂质体Lipofectin包埋后转染人肺癌A549细胞进行培养,采用Western blot法和逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）法检测肺癌A549细胞HPSE蛋白及其mRNA表达的变化；以Transwell细胞侵袭试验检测HPSE ASODN对肺癌A549细胞侵袭力的抑制作用。将ASODN转染成功的人肺癌A549细胞注射于裸鼠皮下建立移植瘤模型,观察移植瘤生长曲线,应用免疫组化方法检测移植瘤内微血管密度（microvessel density, MVD）,比较三组间的差异。采用SPSS13.0软件进行数据处理,数据使用x±s描述,两组间指标比较采用t检验,多组间指标比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。结果第一部分：乙酰肝素酶在人非小细胞肺癌组织中的表达及其意义免疫组化法研究结果表明,HPSE蛋白在非小细胞肺癌组织中存在高表达,其阳性表达率为63.5%；不同病理类型肺癌组织中HPSE蛋白阳性表达率（66.7%、56.3%）无显著性差异（P>0.05）；不同分化程度肺癌组织中HPSE蛋白阳性表达率（63.6%、57.9%、68.2%）亦无显著性差异（P>0.05）；在TNM分期中,Ⅲ期肺癌组织中HPSE蛋白阳性表达率（80.0%）显著高于Ⅱ期（61.5%）和Ⅰ期（45.5%）的肺癌组织（P<0.05）；生存3年以下患者的肺癌HPSE蛋白阳性表达率（82.6%）显著高于生存3年以上者（48.3%）（P<0.05）。第二部分：乙酰肝素酶反义寡核苷酸抑制肺癌A549细胞侵袭力的体外研究RT-PCR结果显示：对照组和脂质体组之间比较,HPSE mRNA表达无明显差异；ASODN各组分别与对照组和脂质体组比较及ASODN各不同浓度组间HPSE mRNA表达具有明显差异；随着ASODN浓度的增加,HPSE mRNA表达逐渐下降,ASODN的抑制作用呈现明显的剂量依赖性。Western blot结果显示ASODN各组HPSE蛋白的表达受到明显抑制,与对照组和脂质体组比较,具有明显差异,并且随着ASODN浓度的增加,HPSE蛋白的表达量逐渐下降,ASODN的抑制作用呈现明显的剂量依赖性。Transwell侵袭实验结果显示：对照组和脂质体组之间比较,侵袭细胞数无明显变化,差异无统计学意义（P＞0.05）；与对照组和脂质体组比较,ASODN各浓度组侵袭细胞数明显减少,差异有统计学意义（P＜0.01）；随着ASODN浓度的增加,ASODN各组侵袭细胞数逐渐减少,组间比较差异有统计学意义（P＜0.01）. ASODN对细胞侵袭力的抑制作用呈明显剂量依赖性,ASODN在终浓度为100、200、400nmol/L时对A549细胞侵袭力的抑制率分别为49.2%、73%、87.5%。第三部分：乙酰肝素酶反义寡核苷酸对裸鼠人肺癌细胞A549皮下移植瘤的抑制作用。脂质体组和对照组移植瘤体积较大,两组肿瘤体积比较无明显差异（P>0.05）。ASODN组成瘤时间晚,移植瘤体积明显小于脂质体组和对照组,差异有统计学意义（P<0.01）. ASODN组、脂质体组和对照组移植瘤的MVD计数分别为13.5±1.8,24.3±2.5和24.7±52.6；脂质体组和对照组比较,两组MVD计数差异无统计学意义（P>0.05）。与脂质体组、对照组比较,ASODN组微血管密度明显降低,差异有统计学意义（P<0.01）结论：1、HPSE的表达在肺癌不同的TNM分期中有明显差异,和患者的不良预后相关,提示HPSE对肺癌的侵袭和转移具有一定的促进作用,可作为判断肺癌转移潜能和患者预后的一个参考指标。2、HPSE ASODN在体外通过下调HPSE mRNA和HPSE蛋白的表达可显著抑制肺癌A549细胞的生长和侵袭,并且抑制作用呈剂量依赖性。3、HPSE ASODN在体内能够明显抑制裸鼠人肺癌移植瘤的生长和血管生成,本实验结果为临床应用HPSE ASODN治疗肺癌提供了一定的实验依据和理论基础,有望成为一种有效的肺癌基因治疗方法。