抗耻垢分枝杆菌的化学遗传学筛选方法的建立

论文摘要

当前在全球范围内,结核病治疗面着非常严峻的形势。一方面,新药研发耗费大,周期长；另一方面,细菌耐药性问题愈严重。寻找新的药物作用靶点是解决上述问题的关键。本论文以化学基因组学为基础,借鉴“高拷贝抑制技术”,在耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）中过表达其基国组的各个基因,通过筛选对活性化合物抗性增加的克隆,寻找可能的作用靶点。将来自穿梭质粒pMV261的oriM和aph基因插入到pCC1FOS载体而获得穿梭载体pEMAC,用该载体住E.coli中构建了M.smegmatis基因组文库。在将该载体及文库质粒导入M. smegmatis后,我们发现这些质粒在M. smegmatis中不能稳定存在。为解决质粒不稳定问题,先后尝试用pMINDcos1载体构建文库和使用pMV261载体构建小片段文库（插入片段35-45kb）,同时通过敲除M. smegmatis recA （?）基因以及对文库质粒去甲基化等手段试图提高质粒稳定性。本学位论文研究结果表明,文库质粒在M. smegmatis中的稳定性可能与插入片段基因—列有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号说明及縮写词
• 第一章 文献综述
• 1.1 结核病与抗结核药物
• 1.1.1 结核病简介
• 1.1.2 抗结核药物研究进展
• 1.1.2.1 利福霉素类
• 1.1.2.2 氟喹诺酮类
• 1.1.2.3 硝基咪唑并吡喃类
• 1.1.2.4 氨基糖苷类
• 1.1.2.5 恶唑烷酮类
• 1.1.2.6 β-内酰胺类抗生素和β-内酰胺酶抑制剂复合物
• 1.1.2.7 吩噻嗪类
• 1.1.2.8 多肽类
• 1.1.2.9 新大环内酯类
• 1.1.2.10 脂肪酸和分枝菌酸合成抑制剂
• 1.1.2.11 二芳基喹啉类
• 1.1.2.12 异烟肼类
• 1.2 药物靶点筛选技术
• 1.2.1 比较基因组学
• 1.2.2 结构基因组学
• 1.2.3 功能基因组学
• 1.2.3.1 基因芯片
• 1.2.3.2 基因中断
• 1.2.3.3 反义核酸
• 1.2.4 蛋白质组学
• 1.2.5 化学基因组学
• 1.3 本论文研究思路
• 第二章 实验部分
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株及质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 载体pEMAC的构建及稳定性
• 2.2.1.1 引物设计
• r）片段的PCR扩增'>2.2.1.2 oriM、aph（即Kan^r）片段的PCR扩增
• 2.2.1.3 pUC18载体、oriM片段及aph片段的酶切、连接
• 2.2.1.4 oriM-aph片段与pCC1FOS的连接
• 2155内的稳定性验证'>2.2.1.5 质粒pEMAC在M.smegmatis mc²155内的稳定性验证
• 2155基因组文库（pEMAC）的构建'>2.2.2 M.smegmatis mc²155基因组文库（pEMAC）的构建
• 2.2.2.1 载体处理
• 2155基因组的提取'>2.2.2.2 M.smegmatis mc²155基因组的提取
• 2.2.2.3 插入DNA的末端修复
• 2.2.2.4 末端修复DNA的分离
• 2.2.2.5 目的DNA片段的回收
• 2.2.2.6 连接
• 2.2.2.7 包装
• 2.2.2.8 感染
• 2.2.2.9 pEMAC文库质粒稳定性验证
• 2.2.3 pMINDcos1载体的构建及稳定性验证
• 2.2.3.1 引物设计
• 2.2.3.2 cos-MCS片段的PCR扩增
• 2.2.3.3 片段与载体的酶切、连接以及验证
• 2.2.3.4 pMINDcos1文库质粒稳定性预检测
• 2155内的稳定性'>2.2.3.5 质粒pMINDcos1在M.smegmatis mc²155内的稳定性
• 2155基因组文库（pMINDcos1）的构建'>2.2.4 M.smegmatis mc²155基因组文库（pMINDcos1）的构建
• 2155基因组小片段文库（pMV261）的构建'>2.2.5 M.smegmatis mc²155基因组小片段文库（pMV261）的构建
• 2155基因组的部分酶切'>2.2.5.1 M.smegmatis mc²155基因组的部分酶切
• 2.2.5.2 载体pMV261的处理
• 2.2.5.3 连接及文库质量检验
• 2155内的稳定性'>2.2.5.4 小片段文库质粒在M.smegmatis mc²155内的稳定性
• 2.2.6 其它针对质粒稳定性的实验
• 2.2.6.1 同源重组对质粒稳定性的影响
• 2.2.6.2 甲基化对质粒稳定性的影响
• 2.2.6.3 突变质粒转化M.smegmatis观察稳定性
• 2.2.7 靶点筛选
• 2.2.7.1 抗生素MIC值的测定
• 2.2.7.2 靶点筛选
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 pEMAC载体及其文库质粒在M.smegmatis中不稳定
• 2.3.2 pMINDcos1文库质粒在M.smegmatis中不稳定
• 2.3.3 部分小片段文库质粒在M.smegmatis中不稳定
• 2.3.4 RecA基因的敲除
• 2.3.5 DNA甲基化与质粒不稳定无关
• 2.3.6 突变质粒再次转化M.smegmatis可保持稳定
• 2.3.7 靶点筛选
• 2.4 结论与讨论
• 全文总结与展望
• 附录
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间主要研究成果
• 学位论文评阅及答辩情况表