胚胎脊髓源性神经干细胞体内外诱导分化及其最佳移植时间和防止骨骼肌失神经萎缩效果的实验研究

论文摘要

臂丛神经下干以及高位正中神经和尺神经损伤后导致的手内在肌萎缩的治疗是周围神经领域的一大难题,手内肌功能的丧失实质上意味着上肢核心功能的丧失,给患者及其家庭和社会带来了沉重的精神和经济负担,因此,加强基础研究、寻找有效方法防治手内在肌萎缩有着重要的理论和现实意义。近年来的研究证明,神经干细胞具有良好的组织相容性和多向分化潜能,体内移植后对神经系统损伤和疾病均具有一定的修复作用。本课题以大鼠胫神经损伤为实验动物模型,较为系统地探讨了胚胎脊髓源性神经干细胞体内外增殖分化的特点以及体内外诱导分化效果,并对基因修饰的胚胎脊髓源性神经干细胞防止骨骼肌失神经萎缩效果进行评价,而且确定了胚胎脊髓源性神经干细胞防止骨骼肌失神经萎缩的最佳移植时间。以期为临床防治骨骼肌失神经萎缩、恢复骨骼肌运动功能提供新的策略和方法。目的:（1）探讨胚胎脊髓源性神经干细胞的分离、培养、鉴定、体外增殖特点和多向分化特性。（2）观察NT3在体内外能否诱导胚胎脊髓源性神经干细胞向胆碱能神经元分化。（3）观察NT3基因修饰的胚胎脊髓源性神经干细胞防止骨骼肌失神经萎缩疗效是否更佳。（4）探讨胚胎脊髓源性神经干细胞移植防止骨骼肌失神经萎缩的最佳移植时间。方法:（1）选用孕龄14—16天SD大鼠胚胎脊髓组织,采用机械分离法获得神经干细胞,并应用无血清神经元限定性培养基进行原代和传代培养,对获得的神经干细胞进行单克隆纯化,然后进行Nestin（巢蛋白）免疫组织化学鉴定;同时将获得的神经干细胞进行体外分化,对分化细胞进行βⅢ-tubulin（βⅢ-微管蛋白）和GFAP（胶质纤维酸性蛋白）免疫组织化学鉴定。在神经干细胞增殖和分化过程中,进行细胞形态学观察。（2）选用孕龄14—16天SD大鼠胚胎脊髓组织获得神经干细胞。体外诱导分化研究:实验组在培养脊髓源性神经干细胞时,应用加入20ng/mlNT3的神经干细胞分化培养液进行诱导培养;对照组则用未加NT3的神经干细胞分化培养液进行分化培养。培养后48小时、1周及3周以ChAT和βⅢ-tubulin为标志物对分化细胞进行免疫组化分析。体内诱导分化研究:应用胫神经切断的方法建立大鼠腓肠肌失神经支配动物模型。将胫神经切断后的40只SD大鼠,随机分成2组:脊髓源性神经干细胞组（对照组）和脊髓源性神经干细胞+NT3组（实验组）,每组20只,各分为术后4、8周两个观察时间点,每个时间点10只动物。实验组将加有20ng/mlNT3的脊髓源性神经干细胞分化培养液混合悬液0.02毫升（105/μl）,应用自制微量注射器将其移植于切断胫神经远端神经外膜下,对照组则用相同方法移植未加NT3的脊髓源性神经干细胞分化培养液混合悬液0.02毫升（105/μl）于切断胫神经远端神经外膜下。于移植后4、8周再次手术获取神经干细胞移植处胫神经,以ChAT和βⅢ-tubulin为标志物进行免疫组化分析。（3）选用孕龄14—16天SD大鼠胚胎脊髓组织获得神经干细胞,应用胫神经切断的方法建立大鼠腓肠肌失神经支配动物模型。构建神经营养因子-3基因慢病毒表达载体,并转染神经干细胞,转染后以RT-PCR和Westernblot检测转染效果。转染后第3,5天观察其体外分化情况。将胫神经切断后的90只SD大鼠,随机分成3组:脊髓源性神经干细胞组、脊髓源性神经干细胞+NT3组和NT3基因修饰脊髓源性神经干细胞组,每组30只,各分为术后1、4、12周三个观察时间点,每个时间点10只动物,应用自制微量注射器移植脊髓源性神经干细胞悬液0.02毫升（105/μl）至切断胫神经远端神经外膜下。于移植后1周再次手术获取神经干细胞移植处胫神经,进行免疫组化分析检测神经干细胞存活;于移植后4周再次手术获取神经干细胞移植处胫神经,胫神经标本以免疫组化及图像分析方法分析神经干细胞分化;于移植后12周再次手术获取神经干细胞移植处胫神经以及腓肠肌并行EMG检查,胫神经标本处理方法同4周组,腓肠肌标本以HE染色及图像分析方法计算腓肠肌肌纤维横截面积。（4）选用孕龄14—16天SD大鼠胚胎脊髓组织获得神经干细胞,应用胫神经切断的方法建立大鼠腓肠肌失神经支配动物模型。将胫神经切断后的90只大SD鼠,随机分成9组,每组10只,分别于胫神经切断后0、1、2、3、4、6、8、12及16周,应用自制微量注射器移植脊髓源性神经干细胞悬液0.02毫升（105/μl）至切断胫神经远端神经外膜下,移植后4周再次手术获取神经干细胞移植处胫神经以及腓肠肌。胫神经标本以免疫组化及图像分析方法计数神经元数量;腓肠肌标本以HE染色及图像分析方法计算腓肠肌肌纤维横截面积。结果:（1）采用机械分离法和无血清培养法可获得大量的神经干细胞,体外培养达两个月之久仍能保持增殖活性,单克隆培养可获得神经干细胞球,对其进行Nestin免疫细胞鉴定为阳性,证明为神经干细胞;神经干细胞体外分化细胞βⅢ-tubulin和GFAP鉴定结果为阳性,证明可分化为神经元和神经胶质细胞。（2）经NT3诱导的脊髓源性神经干细胞用细胞免疫荧光化学法鉴定,体外培养48小时、1周及3周后均可检测到胆碱乙酰基转移酶阳性细胞且细胞数量随时间推移增加,而对照组则未检测到胆碱乙酰基转移酶阳性细胞但可检测到βⅢ-tubulin阳性细胞然而细胞数量随时间推移减少;体内诱导后4及8周后均可检测到胆碱乙酰基转移酶阳性细胞且细胞数量随时间推移增加,而对照组则未检测到胆碱乙酰基转移酶阳性细胞但可检测到βⅢ-tubulin阳性细胞然而细胞数量无明显变化。（3）成功构建神经营养因子-3基因慢病毒表达载体,转染NT3基因的神经干细胞经RT-PCR可扩增出750bp大小片断,而未转染NT3基因的神经干细胞无特异性条带出现。Western blot检测到NT3基因所表达蛋白条带。移植后1周三组均可检测到GFP和Nestin阳性细胞。移植后4周NT3基因组及NT3+NSC组均可检测到GFP和ChAT阳性细胞,但后者数量少于前者（p＜0.01）,移植后12周仅NT3基因组可检测到GFP和ChAT阳性细胞,且NT3基因修饰脊髓源性神经干细胞组的组织学和电生理指标均优于其他两组（p＜0.05）。（4）胫神经切断后1周移植组,其神经元数量及腓肠肌肌纤维横截面积均优于其他组（p＜0.01）,其次为胫神经切断后6周移植组（p＜0.05）。结论:（1）应用无血清神经元限定性培养基可从胚胎脊髓组织中分离获得大量的神经干细胞,这些神经干细胞具有多向分化潜能,能够分化为神经元等多种神经终末细胞。（2）NT3在体内外均可诱导脊髓源性神经干细胞分化为胆碱能神经元。（3）以慢病毒为载体的NT3基因可成功转染胚胎脊髓源性神经干细胞。NT3基因修饰的胚胎脊髓源性神经干细胞在体内外均可存活并可在体内分化为胆碱能神经元,其防止骨骼肌失神经萎缩效果明显优于单纯神经干细胞移植组及NT3诱导的神经干细胞移植组。（4）胚胎脊髓源性神经干细胞移植防止骨骼肌失神经萎缩的最佳移植时间是损伤后1周,其次为6周。

论文目录

• 英文缩略语注释
• 摘要
• Abstract
• 前言
• （一） 失神经骨骼肌萎缩防治的现状
• （二） 神经干细胞-防治骨骼肌失神经萎缩最具临床应用前景的移植细胞
• （三） 神经干细胞应用于骨骼肌失神经萎缩防治前景
• （四） NT-3和GFP相关研究
• 参考文献
• 第一部分 胚胎脊髓源性神经干绌胞分离、培养以及鉴定
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 3体内外诱导胚胎脊髓源性神经干细胞分化的实验研究'>第二部分 NT₃体内外诱导胚胎脊髓源性神经干细胞分化的实验研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 3基因修饰胚胎脊髓源性神经干细胞防止骨骼肌失神经萎缩的实验研究'>第三部分 NT₃基因修饰胚胎脊髓源性神经干细胞防止骨骼肌失神经萎缩的实验研究
• 实验一 携带NT3基因慢病毒表达载体的构建及鉴定
• 实验二 携带NT3基因慢病毒表达载体体外转染神经干细胞及其表达的研究
• 实验三 NT3基因修饰神经干细胞防止骨骼肌失神经萎缩研究
• 小结
• 参考文献
• 第四部分 胚胎脊髓源性神经干细胞移植防止骨骼肌失神经萎缩最佳移植时间的实验研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 全文小结
• 综述 神经干细胞移植防止骨骼肌失神经萎缩
• 参考文献
• 附录
• 致谢