论文摘要
研究背景与目的世界上大约有10%的女人患有乳腺癌，因其容易转移而对女性的健康造成了极大的威胁。S100A4是S100钙黏蛋白家族成员，分子量约为11.5KD，由101个氨基酸残基构成，可以存在于胞核、胞浆以及细胞微环境中，研究发现它的高表达可以促进风湿性关节炎、肾纤维化、肝纤维化等疾病发展，同时它与肿瘤发展也密切相关。Wnt信号途径与细胞的增殖、分化以及凋亡等有着密切联系；目前的研究表明显示Wnt途径的异常与肿瘤的发生有紧密联系，乳腺癌中就存在着Wnt途径的异常，该途径可以分为依赖β-catenin的经典信号途径（即Wnt/β-catenin途径）和不依赖β-catenin的非经典信号途径。β-catenin是Wnt/β-catenin途径的关键分子，其胞内水平可以指示该途径的活性，它在细胞内主要由GSK-3β等组成的降解复合物磷酸化后加以降解；非经典Wnt途径之一是Wnt/c-Jun NH2-terminalkinases （JNK）途径。本课题采用携带S100A4基因的缺陷型腺病毒（AdenovirusS100A4，AdS100A4）感染目的细胞系，使其过表达S100A4而探讨它对人乳腺上皮细胞HBL-100和人乳腺癌上皮细胞MCF-7增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响，并研究它对这两种细胞中β-catenin水平、GSK3β活性和JNK活性的影响，为阐明S100A4对乳腺癌的作用及其可能的机制提供相关的实验依据。方法1.重组腺病毒AdS100A4的扩增及其感染滴度的测定。2.用RT-PCR及Western Blot的方法鉴定S100A4在HBL-100和MCF-7细胞中的内源性表达以及AdS100A4感染后的HBL-100和MCF-7细胞中S100A4的表达水平变化。3.病毒分别感染细胞后采用MTT检测细胞增殖、划痕愈合以及Transwell迁移实验检测细胞迁移能力、Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力以及Hoechst染色检测细胞的凋亡。4.采用RT-PCR和/或Western Blot检测S100A4对细胞内β-catenin水平、c-Myc的表达和GSK3β磷酸化水平的影响，以检测Wnt/β-catenin途径是否参与S100A4对乳腺癌的作用。5.采用Western Blot或PCR检测S100A4对细胞中JNK的磷酸化水平以及c-Fos mRNA水平的影响，以探讨Wnt/JNK途径是否参与介导S100A4对乳腺癌的作用机制。结果1. AdS100A4感染的HEK293细胞中可见绿色荧光，加入病毒72h时感染率达90％左右；算得病毒的滴度为：2×1011IU/ml。2. RT-PCR与Western Blot均未检出HBL-100细胞中有S100A4的表达；而在MCF-7细胞中可以检测到S100A4的存在。3.AdS100A4感染后，两种细胞的S100A4表达都有显著增加。提示AdS100A4携带的S100A4目的基因可以在这两种细胞中表达S100A4蛋白，表明AdS100A4是有效的干预工具。4.MTT结果显示：1)AdS100A4感染4天后，HBL-100和MCF-7细胞的增殖较对照组分别增加52.8%（P＜0.05）和50.5%（P＜0.05），提示S100A4可以促进HBL-100和MCF-7细胞的增殖。5.划痕愈合以及Transwell迁移实验都可以发现：1)经AdS100A4处理的HBL-100和MCF-7的细胞的24h的划痕愈合率分别比相应对照组增加73.6%（P＜0.05）和64.8%（P＜0.05），与之一致的是，它们的穿膜细胞数也较相应对照组分别增加1.73倍（P＜0.05）和1.95倍（P＜0.05）；这两种方法都提示S100A4具有促进这两种细胞迁移的功能。6.Transwell侵袭实验发现：1)AdS100A4处理的HBL-100细胞的穿膜细胞数为5个与对照组的5个无显著性差异；2)AdS100A4处理的MCF-7细胞的穿膜细胞数约为GFP组的2倍（P＜0.05）。这提示S100A4对HBL-100的侵袭能力无明显影响，但是其可以显著增强MCF-7的侵袭能力。7.Hoechst染色显示：1)HBL-100细胞：AdS100A4处理24h的凋亡率为5.5%，较GFP组无显著性差异（P＞0.05）；48h的凋亡率较GFP组减少了29.9%（P＜0.05）；2)MCF-7细胞：AdS100A4处理24h的凋亡率为3.62%，较GFP组无显著性差异（P＞0.05）；48h的凋亡率较GFP组减少35.8%（P＜0.05）。提示S100A4可以抑制这两种细胞发生凋亡。8.S100A4对Wnt/β-catenin途径的影响：8-1Western Blot显示：1)S100A4处理的HBL-100和MCF-7细胞中β-catenin的校正灰度较相应的GFP组分别增加了49%（P＜0.05）和55%（P＜0.05）；2)S100A4处理的HBL-100和MCF-7细胞中c-Myc的校正灰度值较相应对照组分别增加38%（P＜0.05）和30%（P＜0.05），提示S100A4能活化Wnt/β-catenin途径。8-2RT-PCR显示：S100A4对HBL-100和MCF-7细胞中β-catenin的转录无明显影响；Western Blot显示：S100A4处理的HBL-100和MCF-7细胞中磷酸化的GSK3β（P-GSK3β）校正灰度值较相应对照组分别增加73%（P＜0.05）和55%（P＜0.05），提示细胞中β-catenin水平增高：1)不涉及此基因的转录水平的调控；2)其机制之一是通过增加GSK3β的磷酸化而抑制它的降解。8-3分析Weatern Blot校正灰度值得出：1)AdS100A4感染的HBL-100细胞中的β-catenin校正灰度较MCF-7组低36.6%（P＜0.05）；2)经AdS100A4感染的HBL-100细胞中P-GSK3β校正灰度值较MCF-7细胞高35.7%（P＜0.05）；3)经AdS100A4感染的HBL-100细胞中c-Myc的校正灰度值较MCF-7细胞低17.5%（P＜0.05），这提示S100A4激活Wnt/β-catenin途径的作用在MCF-7细胞中比在HBL-100更强。上述结果提示：S100A4可以激活HBL-100和MCF-7细胞中的Wnt/β-catenin途径，在MCF-7细胞中对此途径作用更强，该信号途径被上调的机制之一是通过促进GSK3β的磷酸化来实现的。9. S100A4对Wnt/JNK信号途径的影响9-1PCR和Western Blot显示：S100A4对HBL-100中的P-JNK以及c-Fos的mRNA水平无明显影响。9-2PCR和Western Blot结果显示：S100A4在MCF-7细胞中可以增加39%的P-JNK水平（P＜0.05），同时也可以使此细胞中的c-FosmRNA水平也增加32.3%（P＜0.05）。提示S100A4对HBL-100细胞中的Wnt/JNK信号途径活性无明显影响，但是可以激活MCF-7细胞中的Wnt/JNK信号途径。结论1.AdS100A4在HEK293细胞中可以成功扩增。2.HBL-100细胞中可能没有S100A4的表达或其表达低于所用方法检测限；MCF-7细胞中有S100A4表达。3.本课题所用的重组腺病毒AdS100A4所携带的S100A4基因可以在被其感染的目的细胞（HBL-100和MCF-7）中成功表达。4.S100A4能明显促进HBL-100细胞的增殖、迁移并抑制其凋亡，对它的侵袭能力没有明显的影响。5.S100A4能明显促进MCF-7细胞的增殖、迁移并抑制其凋亡，同时还能增强其侵袭能力。这提示S100A4可能参与了乳腺癌的发生发展。6.S100A4可上调HBL-100和MCF-7细胞内的Wnt/β-catenin途径，这可能是S100A4对这两种细胞作用的部分机制；S100A4上调此途径中关键分子β-catenin的机制与其促进GSK3β的磷酸化（进而抑制细胞内β-catenin的降解）有关，但是与β-catenin基因的转录水平调控无关。7.S100A4对HBL-100细胞的作用机制不涉及Wnt/JNK途径。8.S100A4上调MCF-7细胞中Wnt/JNK/c-Fos途径，这可能是介导S100A4对MCF-7细胞作用的又一机制。
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