运动发酵单胞菌基因操作体系的改进及其在生物炼制过程中的应用

论文摘要

运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）是一种革兰氏阴性兼性厌氧细菌。由于其高效的乙醇发酵性能和独特的代谢特征,该菌株在生物炼制领域被认为具有广阔的应用前景。深入开展运动发酵单胞菌代谢工程等方面的研究,将有助于推动其在生物炼制中的广泛应用。但由于目前运动发酵单胞菌基因操作体系存在效率较低、假阳性率高、大质粒操作困难和克隆位点极有限等缺陷,严重阻碍了代谢工程在该菌株中的开展。本学位论文首先对运动发酵单胞菌现有的基因操作体系给予了改进,并通过新构建的pHW20a质粒将同源和异源基因分别在该菌株中进行了表达。借助于所构建的各种运动发酵单胞菌重组菌,对该菌株的生理代谢规律及限制其在生物炼制过程中应用的若干因素进行了一些探讨。基因工程是认识微生物生理代谢的一个基本手段。建立基因工程操作所必需的高效和便捷的基因操作体系,对于微生物代谢途径重构具有十分重要的意义。本论文首先在运动发酵单胞菌已有可移动质粒pLOI193的基础上,通过质粒结构的精简以及不同来源功能基因的优化整合,获得了一个高转化效率的接合穿梭质粒pHW20a。实验证明,该质粒的接合转化效率比pLOI193高约两个数量级。借助于pHW20a质粒将来源于大肠杆菌（Escherichia coli） BL21 （DE3）的苹果酸脱氢酶基因（mdh）,来源于酿酒酵母的NAD+-依赖型甲酸脱氢酶基因（FDH1）以及运动发酵单胞菌ZM4菌株自身的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（ppc）和葡萄糖-果糖氧化还原酶基因（gfo）在运动发酵单胞菌ZM4菌株中分别进行了表达。通过对pHW20a及其衍生质粒转化效率和稳定性的研究,揭示了影响可移动质粒接合转化效率和稳定性的关键因素。基于运动发酵单胞菌mdh基因表达重组菌的初步研究结果,本论文对ppc基因在运动发酵单胞菌代谢中的作用进行了探讨。在现有报道中,磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（Phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPCase）通常作为微生物的回补途径而用于草酰乙酸的合成。本研究通过同源重组,将运动发酵单胞菌ZM4菌株中的ppc基因进行敲除。通过研究突变株在生长上对ppc基因缺失的响应,证实运动发酵单胞菌以PEPCase途径作为由葡萄糖合成草酰乙酸的唯一途径而在合成代谢中发挥着极其重要的作用,同时也揭示了运动发酵单胞菌不同于一般微生物的代谢特点。随后,通过研究草酰乙酸对运动发酵单胞菌生长的促进作用以及ppc基因表达水平对宿主细胞生理代谢的影响,初步确认ppc基因可能借助转录水平的变化而在其碳代谢和能量代谢上的调节作用,进一步认识了运动发酵单胞菌非耦联生长的复杂调控机制。基于gfo基因在运动发酵单胞中的过量表达,对生物法制备山梨醇的催化细胞进行了发酵制备。并通过发酵过程变量分析,获知了运动发酵单胞菌限制基因过量表达的潜在因素。利用gfo过表达菌株和金属离子抑制剂等手段,明显提高了生物法制备山梨醇的过程效率和收率,由此改善了限制生物法制备山梨醇应用的关键问题。基于FDHl基因在运动发酵单胞菌中的表达,甲酸代谢途径和NADH再生体系在该菌株中得到成功建立。FDH1基因的表达,使得重组菌在代谢甲酸的同时实现了NADH的再生,从而显著改善了运动发酵单胞菌对甲酸和呋喃类抑制物的耐受性和（或）代谢性能。玉米秸秆水解液发酵实验证实,重组菌的生长和乙醇发酵性能均得到了明显加强。重组菌乙醇发酵结束时,其细胞浓度和乙醇收率比对照菌株均提高了一倍左右。通过本研究在运动发酵单胞菌体系中证实了加强胞内NADH水平可提高乙醇发酵菌株耐受和代谢呋喃类抑制物。本研究发现NADH的充分供给有可能在增强运动发酵单胞菌耐受（或代谢）芳香族抑制物上亦发挥重要的作用。本学位论文通过对运动发酵单胞菌基因操作体系的改进及菌株生理和代谢的研究,总结了运动发酵单胞菌基因工程和代谢工程研究的一些基本规律,从而为推广运动发酵单胞菌在生物炼制过程的应用奠定了理论基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 生物炼制与微生物的作用
• 1.2 运动发酵单胞菌及其代谢的研究进展
• 1.2.1 运动发酵单胞菌的发现、特点及分类
• 1.2.2 运动发酵单胞菌基本代谢途径的研究进展
• 1.3 运动发酵单胞菌中的非耦联生长现象
• 1.3.1 非耦联生长——葡萄糖的快速代谢
• 1.3.2 非耦联生长——ATP溢出反应
• 1.4 运动发酵单胞菌基因操作体系及其代谢工程研究进展
• 1.4.1 运动发酵单胞菌基因操作体系的研究进展
• 1.4.2 运动发酵单胞菌代谢工程研究进展
• 1.5 题目的及意义
• 1.6 本论文主要研究内容
• 1.6.1 运动发酵单胞菌基因操作体系的改进
• 1.6.2 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶调控运动发酵单胞菌非耦联生长的初步研究
• 1.6.3 重组运动发酵单胞菌应用于山梨醇生物催化制备过程的研究
• 1.6.4 运动发酵单胞菌甲酸代谢途径和NADH再生体系的构建及其在玉米秸秆水解液发酵中的应用
• 第二章 运动发酵单胞菌基因操作体系的改进
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验及分析方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 穿梭质粒pHW20a的构建
• r的构建'>2.3.2 穿梭质粒pBBR1MCS-2-tc^r的构建
• 2.3.3 Gfo基因过表达菌株——运动发酵单胞菌ZM4（pHW20a-gfo）的构建
• 2.3.4 Mdh基因表达菌株——运动发酵单胞菌ZM4（pHW20a-mdh）的构建
• 2.3.5 pHW20a及其衍生质粒接合转化效率的比较
• 2.3.6 pHW20a及其衍生质粒在宿主中稳定性的研究
• 2.3.7 借助pHW20a在运动发酵单胞菌中表达功能基因的应用
• 2.3.8 运动发酵单胞菌ZM4批式发酵过程中ppc转录水平的研究
• 2.4 小结
• 第三章 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶在运动发酵单胞菌代谢过程中的作用
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验及分析方法
• 3.3 结果与讨论
• r敲除质粒的构建'>3.3.1 pUC19-ppc::tc^r敲除质粒的构建
• 3.3.2 Ppc过表达质粒pHW20a-Pgap-ppc和pHW20a-Pppc-ppc的构建及转化
• 3.3.3 运动发酵单胞菌ZM4菌株生理代谢的初步研究
• 3.4 小结
• 第四章 运动发酵单胞菌重组菌应用于山梨醇生物制备过程的研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验及分析方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 利用gfo高表达菌株制备山梨醇生物催化细胞
• 4.3.2 Gfo高表达对山梨醇细胞催化反应的促进作用
• 4.3.3 金属离子对改善细胞催化反应性能的评价
• 2+和Ca²⁺浓度对催化生产山梨醇的促进作用'>4.3.4 Zn²⁺和Ca²⁺浓度对催化生产山梨醇的促进作用
• 4·7H₂O抑制与反复冻融对细胞催化生产山梨醇的性能评价'>4.3.5 ZnSO₄·7H₂O抑制与反复冻融对细胞催化生产山梨醇的性能评价
• 4.4 小结
• 第五章 运动发酵单胞菌甲酸代谢途径和NADH再生体系的构建及其在玉米秸秆水解液发酵中的应用
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 实验及分析方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 运动发酵单胞菌FDH1基因表达重组菌的构建
• 5.3.2 FDH1基因表达对运动发酵单胞菌甲酸代谢及甲酸耐受性的促进作用
• 5.3.3 NADH再生体系在运动发酵单胞菌中的建立及对胞内NADH水平的改善
• 5.3.4 NADH再生体系对运动发酵单胞菌呋喃类抑制物耐受性能改善作用的评价
• 5.3.5 NADH再生体系对运动发酵单胞菌代谢甲酸和呋喃类化合物的促进作用
• 5.3.6 在玉米秸秆水解液体系中FDH1基因表达对运动发酵单胞菌发酵性能的改善
• 5.3.7 NADH再生体系对运动发酵单胞菌耐受芳香族抑制物性能的促进作用
• 5.4 小结
• 第六章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.1.1 运动发酵单胞菌基因操作体系的改进
• 6.1.2 PEPCase在运动发酵单胞菌代谢中的作用
• 6.1.3 运动发酵单胞菌重组菌应用于山梨醇生物制备过程的研究
• 6.1.4 运动发酵单胞菌甲酸代谢途径和NADH再生体系的构建及其在玉米秸秆水解液发酵中的应用
• 6.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 博士期间研究成果
• 致谢