仿刺参肠道细菌多样性16S rDNA分析

论文摘要

本文通过构建细菌16S rDNA克隆文库和聚合酶链式反应／变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）两种不同的分子生物学方法对仿刺参肠道细菌多样性进行分析。构建16S rDNA克隆文库,共挑取470个阳性克隆子,经Hinf Ⅰ和Hae III酶切分析后,将188个PCR产物进行序列测定,最终确定106个可操作分类单元（OTUs）。克隆文库库容覆盖率为77.4%。通过NCBI数据库的BLAST搜索发现,相似率从88%到100%,共有21个OTUs（19.8%）的序列相似率小于98%,鉴定出8类主要的系统发育菌群,分别是：y-Proteobacteria（76.4%）, a-Proteobacteria（6.6%）, Firmicute（6.6%）, s-Proteobacteria（5.7%）, Actinobacteria（1.9%）,8-Proteobacteria（0.9%）, Fusobacteria（0.9%）和Verrucomicrobia （0.9%）,其中约88.7%的序列隶属于Proteobacteria,其中y-Proteobacteria为其主要菌群包含81个OTUs。在克隆文库中有18个OTUs序列相似率小于97%,可视为我新发现菌种。仿刺参肠道细菌分属于22个菌属,分别为：Arcobacter, Vibrio, Psychrobacter, Pseudomonas, Bacillus, Photobacterium, Francisella, Legionella, Acinetobacter, Acanthamoeba, Staphylococcus, Brachybacterium Pseudoalteromonas, Streptomyces, Shewanella, Aerococcus, Holosporaceae bacterium, uncultured bacterium, Aliivibrio, Thalassomonas, Neptunomonas和 Fangia hongkongensis,其中Vibrio为仿刺参肠道细菌中的主要菌属。采用16S rDNA V3区的PCR-DGGE基因指纹技术对仿刺参肠道细菌的优势菌群进行分析,共得到16个不同差异的条带,经过切胶、克隆、测序等步骤分析。通过总结,这些优势菌群为：Pseudoalteromonas, Vibrio, Propionigenium, Pseudomonas, Shewanella, Leisingera, Arcobacter, Alistipes, Ferrimonas和Rhodobacteraceae,其中Vibrio为仿刺参肠道细菌中的优势菌属。结果表明,16S rDNA克隆文库和PCR-DGGE是两种有效地分子生物学方法用来监测和分析仿刺参肠道细菌多样性,为仿刺参水产养殖业更好的发展提供了重要的信息。两种方法均表明,刺参肠道细菌的主要菌群为Proteobacteria,优势菌属为Vibrio。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 综述
• 1.1 仿刺参
• 1.1.1 仿刺参概况
• 1.1.2 仿刺参的营养价值
• 1.2 肠道菌群
• 1.2.1 肠道菌群的作用
• 1.2.2 肠道菌群的研究现状
• 1.3 菌群多样性的研究方法
• 1.3.1 细菌常规鉴定法
• 1.3.2 16S rDNA基因技术
• 1.3.3 限制性片段长度多态性（RFLP）分析技术
• 1.3.4 聚合酶链式反应（PCR）技术
• 1.3.4.1 PCR反应的基本原理
• 1.3.4.2 PCR反应的影响因素
• 1.3.4.3 PCR反应固有的偏差
• 1.3.5 基因克隆技术
• 1.3.6 变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术
• 1.4 本论文的研究内容与意义
• 第二章 16SrDNA克隆文库法分析仿刺参肠道细菌多样性
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验样品
• 2.1.2 主要培养基
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 主要试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 样品的处理
• 2.2.2 仿刺参肠道细菌总DNA的提取
• 2.2.3 DNA模板的检测
• 2.2.4 16S rDNA片段的PCR扩增
• 2.2.5 PCR产物的回收纯化
• 2.2.6 构建细菌16S rDNA克隆文库
• 2.2.6.1 回收纯化PCR产物与pMD19-T载体的连接
• 2.2.6.2 转化
• 2.2.6.3 阳性克隆子的筛选
• 2.2.6.4 限制性片段长度多态性（RFLP）分析及克隆文库覆盖率检测
• 2.2.7 细菌16S rDNA片段测序及菌种鉴定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 细菌基因组DNA提取和16S rDNA片段的PCR扩增
• 2.3.2 构建细菌16SrDNA克隆文库及覆盖率
• 2.3.3 细菌16S rDNA基因序列分析
• 第三章 变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析仿刺参肠道细菌多样性
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验样品
• 3.1.2 主要培养基
• 3.1.3 主要仪器
• 3.1.4 主要试剂
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 样品处理
• 3.2.2 肠道总细菌DNA提取
• 3.2.3 DNA模板的检测
• 3.2.4 16S rDNA V3区的PCR扩增
• 3.2.5 变性梯度凝胶电泳（DGGE）
• 3.2.5.1 仪器的预处理
• 3.2.5.2 DGGE所需溶液的配制
• 3.2.5.3 线性梯度胶的制备
• 3.2.5.4 加样、电泳及染色
• 3.2.6 回收DGGE胶液中的16S rDNA V3区片段及PCR扩增
• 3.2.7 PCR产物的回收纯化
• 3.2.8 克隆
• 3.2.8.1 PCR回收纯化产物与pMD19-T载体的连接
• 3.2.8.2 蓝白斑筛选
• 3.2.8.3 阳性菌落PCR扩增
• 3.2.9 菌液测序及序列结果分析
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 16S rDNA V3区片段的PCR扩增
• 3.3.2 DGGGE指纹图谱及其分析
• 3.3.3 回收DGGE胶液中的16S rDNA V3区片段并PCR扩增
• 3.3.4 PCR产物的回收纯化
• 3.3.5 克隆结果
• 3.3.5.1 蓝白斑筛选
• 3.3.5.2 阳性菌落PCR扩增
• 3.3.5.3 菌液测序
• 3.3.6 测序结果的序列系统发育树分析
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录