猪流感病毒H3N2亚型HA基因的表达以及免疫效力的研究

论文摘要

猪流感病毒血清学调查结果表明,我国猪群广泛存在H3N2亚型流感病毒,为了有效的控制猪流感的发生,研制有效的疫苗进行预防是控制流感发生和切断禽-猪-人传播途径的有效方法,目前用于猪流感的疫苗主要为灭活疫苗,相对于禽流感疫苗由传统的全病毒灭活疫苗、亚单位疫苗、重组活载体疫苗、基因疫苗的发展而言,猪流感的疫苗研发相对落后。本试验选取猪流感病毒株的HA基因做为研究对象,主要做了以下研究:1、猪流感病毒A/Swine/Sichuan/01/2006（H3N2）HA基因的原核表达载体的构建本试验根据HA蛋白全基因序列和原核表达载体pET32a（+）,设计了一对包含HA基因开放阅读框（去除信号肽）约1680bp,同时引入Sacl和NotI酶切位点的一对引物;将PCR产物回收后连接pMD18-T载体,转化DH5a感受态细胞,经鉴定筛选阳性克隆菌抽质粒进行双酶切,同时对pET32a（+）进行双酶切,将二者回收后连接并转化DH5α。筛选阳性菌落进行IPTG诱导表达,表达产物经聚丙酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）检测,未见目的性蛋白条带,推测可能是由于表达片段较长,导致宿主菌代谢负担过载或HA基因中有影响HA表达的序列或元件。2、猪流感病毒A/Swine/Sichuan/01/2006（H3N2）HA基因的真核表达载体的构建与表达HA基因是猪流感病毒重要的保护性抗原基因。为了研究HA基因疫苗,用PCR扩增猪流感病毒HA基因,全长1701bp,经KpnI和NotI双酶切将其克隆到pcDNA3.1（+）上得到真核表达质粒pcDNA3.1-HA。重组质粒pcDNA-HA经在脂质体介导下转染Vero细胞,通过间接免疫荧光分析,证明HA基因在Vero细胞中成功地进行了瞬时表达。3、HA DNA疫苗的小鼠免疫和攻毒保护试验用聚乙二醇方法大量提取、纯化重组质粒pcDNA-HA;用0.1%的福尔马林溶液灭活猪流感病毒A/Swine/Sichuan/01/2006（H3N2）。6-8周龄小鼠分为四组,第一组灭活全病毒100ul,免疫2次;第二组用表达HA的DNA疫苗pcDNA-HA100ug免疫二次;第三组用表达HA的DNA疫苗pcDNA-HA100ug初次免疫,灭活全病毒100ul加强免疫。第四组对照组没有免疫作为阴性对照。每组10只,免疫二次,间隔三周。加强免疫二周后小鼠断尾采血,分离血清,用血凝抑制试验（HI）测定血清中抗体水平;加强免疫三周后用7%戊巴比妥钠麻醉小鼠,然后用104EID50的猪流感H3N2型病毒滴鼻攻击,观察小鼠发病状况。攻毒后第3d、第9d每组随机抽取3只,取小鼠肺洗液测定肺部病毒残存;攻毒后第9d,小鼠断尾采血,分离血清,用血凝抑制试验（HI）测定血清抗体水平。结果表明加强免疫后,各免疫组都能产生抗体,第二组与其他两组相比,抗体水平偏低,第一组和第三组差异不显著;攻毒后第9d,检测到第一组、第二、三组抗体水平都有升高,各免疫组之间差异不显著,各免疫组与对照组之间差异极显著（P＜0.01）,第二组在攻毒后抗体水平增长幅度较大,表明HA DNA有可能有一定加强免疫的作用;攻毒后第9d对各组小鼠肺部病毒残存的检测表明各免疫程序都能清除小鼠体内病毒。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 1 猪流感病毒的概况
• 1.1 猪流感病毒病毒的分型
• 1.2 猪流感病毒的一般生物学特性
• 1.3 猪流感病毒编码蛋白
• 1.4 猪流感病毒的变异
• 1.5 SIV的种间传播及公共卫生
• 2 H3N2亚型流感病毒研究进展
• 2.1 H3N2亚型猪流感流行情况
• 2.2 我国H3N2亚型猪流感病毒疫苗研究进展
• 3 展望
• 第二章 HA基因原核表达载体的构建
• 1 材料
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要试剂及其配制
• 1.3 主要仪器设备
• 2 方法
• 2.1 HA序列分析
• 2.2 HA基因的扩增
• 2.3 HA基因的亚克隆
• 2.4 重组pMD18-T-HA质粒的抽提及鉴定
• 2.5 重组表达质粒pET32a-HA的构建
• 2.6 原核表达质粒pET32-HA转化表达菌BL21
• 2.7 重组表达质粒pET32a-HA的鉴定
• 2.8 HA基因在大肠杆菌中的诱导表达
• 3 结果与分析
• 3.1 HA基因序列分析
• 3.2 重组pMD18-T-HA质粒的的鉴定
• 3.3 重组表达质粒pET32a-HA的鉴定
• 3.4 重组表达质粒的诱导表达
• 4 讨论
• 第三章 HA基因的真核表达
• 1 材料
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要试剂及其配制
• 1.3 主要仪器设备
• 2 实验方法
• 2.1 HA基因的扩增
• 2.2 HA基因的亚克隆
• 2.3 重组pMD18-T-HA质粒的抽提及鉴定
• 2.4 重组质粒pcDNA3.1-HA的构建
• 2.5 真核表达质粒pcDNA3.1-HA转化
• 2.6 重组质粒pcDNA3.1-HA的鉴定
• 2.7 高免血清的制备
• 2.8 重组质粒pCDNA-HA脂质体法转染VERO细胞
• 2.9 表达产物的间接免疫荧光鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 重组pMD18-T-HA质粒的的鉴定
• 3.2 重组表达质粒pcDNA3.1-HA的鉴定
• 3.3 表达产物的间接荧光鉴定
• 4 讨论
• 第四章 猪流感HA DNA疫苗免疫效果研究
• 1 材料
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要试剂及其配制
• 2 实验方法
• 2.1 真核表达质粒pcDNA3.1-HA的大量制备与纯化
• 2.2 猪流感病毒的增值
• 50)的测定'>2.3 猪流感病毒鸡胚半数感染力(EID₅₀)的测定
• 2.4 猪流感H3N2亚型病毒的灭活
• 2.5 动物实验
• 2.5.1 实验动物的分组及免疫
• 2.5.2 保护性试验
• 2.5.3 小鼠血清抗体水平的检测
• 3 结果与分析
• 3.1 抽提的pcDNA3.1-HA的浓度测定
• 3.2 鸡胚半数感染量的测定结果
• 3.3 猪流感H3N2亚型病毒效价测定结果
• 3.4 小鼠血清制备
• 3.5 小鼠血液抗体效价血凝抑制（HI）试验结果
• 3.6 小鼠攻毒后体重变化情况
• 3.7 小鼠剖杀后病毒滴定结果
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢