重组大肠杆菌酒石酸脱氢酶β亚基体外分子交联的初步研究

论文摘要

本实验以大肠杆菌酒石酸脱氢酶β亚基（TtdB）为研究材料,探索了其在体外的交联情况。首先利用PCR技术从大肠杆菌BL21中获取TtdB基因,克隆到PGM-T载体并测序;序列测定无误后连接到表达载体pTrcHisC,IPTG诱导表达。重组蛋白以包含体形式存在,应用TALON固定化金属亲和树脂以变性的方法纯化,通过分步透析逐步去除变性剂的方法复性,复性率可达70%。将复性后的蛋白与溶菌酶通过热诱导去折叠和氧化重折叠方法进行体外蛋白质分子交联实验。结果表明:蛋白质在其变性的临界温度反应时,出现交联二聚体和多聚体;这些蛋白质分子间交联包括分子间二硫键和异肽键;在氧化重折叠反应液中加入还原剂二硫苏糖醇（DTT）后,不但没有分子间二硫键形成,也没有异肽键形成。实验还发现lysozyme和TtdB间亦能形成交联。另外,本文还利用PCR定点突变技术将此TtdB基因的6个半胱氨酸全部突变为丝氨酸,突变后的重组蛋白在与野生型蛋白相同的热诱导去折叠条件下,完全没有二聚体和多聚体的形成。 以上结果进一步证明了蛋白质体外交联可通过以下三步进行:1)蛋白质构象包括二级结构的改变;2)形成分子间二硫键;3)形成分子间异肽键且分子间二硫键能促进随后异肽键的形成。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略表
• 第一章 综述
• 1.1 蛋白质折叠概述
• 1.1.1 体外蛋白质折叠
• 1.1.2 体内蛋白质折叠
• 1.1.3 生物工程中的蛋白质折叠
• 1.2 蛋白质交联概述
• 1.2.1 蛋白质交联的重要性
• 1.2.2 蛋白质交联机理
• 1.3 本文研究对象及技术路线
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 野生型TtdB基因的克隆、目的蛋白的获得及体外蛋白交联实验
• 2.2.2 突变型TtdB基因的克隆、目的蛋白的获得及体外蛋白交联实验
• 第三章 结果
• 3.1 野生型TtdB基因的克隆、目的蛋白的获得及体外蛋白交联实验结果
• 3.2 突变型TtdB基因的克隆、目的蛋白的获得及体外蛋白交联实验结果
• 第四章 讨论
• 4.1 PCR引物设计
• 4.2 克隆载体和表达载体的选择
• 4.3 TALON金属亲和层析技术（IMAC）纯化融合蛋白
• 4.4 包含体的复性
• 4.5 本实验对蛋白质交联三步假说的证明
• 小结
• 参考文献
• 附图
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文