旱稻耐盐基因的转化及耐盐性试验

论文摘要

本研究采用基因工程的手段将甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因转入到已经具有1-磷酸甘露醇脱氢酶（mtlD）基因并稳定遗传的旱稻297、旱稻277、旱稻502材料中,以期增加旱稻的耐盐性,解决盐碱地的开发利用问题,同时推动旱稻的大面积推广。 以胚性愈伤组织为受体材料,利用农杆菌介导法将BADH基因导入旱稻材料。对外源基因在旱稻植株中的整合和表达情况进行了研究,同时在转化过程中,对影响转化的各个因素做了进一步的探讨,从而进一步完善早稻的遗传转化体系。 经过PCR检测和Southern杂交证明,BADH基因也整合到旱稻基因组中,再经PCR检测,BADH基因和mtlD基因同时导入旱稻材料中。获得同时转入BADH基因和mtlD基因的植株共有44株,其中旱稻502植株中有28株,旱稻277植株中有9株,旱稻297中有7株。对转基因植株后代T1进行反转录PCR证明,BADH基因在旱稻材料中得到表达。 转双基因植株T0代生长情况总体看来,株高明显下降,穗长明显变短,成穗率也下降,转化植株生育期延长,64.2%的转化植株可育,但育性普遍下降,并且各株之间结实率差异较大。 将已经转入mtlD基因的并稳定遗传的T5代单基因材料和已经转入BADH基因T2代的单基因材料在山东东营0.5%-0.6%NaCl的盐碱地上种植选择,大部分转基因植株正常生长,非转基因对照植株（旱稻502最严重）几乎不能生长。经过主要农艺性状的观察,以及PCR检测,以及耐盐性检测,已选育出优良株系9个:T008,T006,T526,T566,T410,T461,T036,T122,T136。这些品系,稻米品质达到国家1-2级米标准,单株产量在7.895-12.89g之间。 转基因植株耐盐性试验表明,转双基因植株的耐盐性得到明显的提高,能达到0.75%（质量/体积）NaCl的耐盐能力;而在此盐浓度下,非转基因植株是不能生长的。 转单基因旱稻植株与转双基因植株的在0.75%（质量/体积）NaCl水培条件下,耐盐性比较实验发现,无论是它们所表现出来的盐害症状的差异,还是转基因旱稻的叶片相对电导率结果以及地上部、地下部Na+/K+含量的测定结果都表明,转双基因植株比转单基因植株表现出更好的耐盐性。因此,推断出这两个耐盐基因起到了一定的协同（或累加）效应。这也证明了在植物耐盐碱这种数量性状的改良上,进行多基因转化来改良的方法是可行的。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言（文献综述及立题依据）
• 1.1 基因枪转化技术
• 1.2 农杆菌转化技术
• 1.2.1 农杆菌介导的转化机理
• 1.2.2 影响农杆菌法转化效率的因素
• 1.3 启动子
• 1.4 多种转基因方法协同作用
• 1.5 多基因转化
• 1.5.1 表达载体构建
• 1.5.2 共转化
• 1.6 转基因沉默
• 1.7 水稻遗传转化研究进展
• 1.7.1 抗病性改良
• 1.7.2 抗虫性改良
• 1.7.3 品质改良
• 1.7.4 抗逆性改良
• 1.8 旱稻遗传转化研究进展
• 1.9 植物耐盐基因工程研究进展
• 1.9.1 植物盐害
• 1.9.2 植物抗盐机理
• 1.9.3 植物抗盐基因工程研究进展
• 1.10 立题依据
• 第二章 材料和方法
• 2.1 旱稻品种
• 2.2 质粒和菌株
• 2.3 培养基
• 2.4 外植体的获取
• 2.4.1 成熟胚
• 2.4.2 幼胚
• 2.5 农杆菌转化
• 2.5.1 用冻融法将质粒转入农杆菌
• 2.5.2 快速提取质粒检测转化子
• 2.5.3 农杆菌转化愈伤组织
• 2.5.4 抗性愈伤的筛选及植株再生
• 2.6 水稻总DNA的提取
• 2.6.1 大量提取总DNA
• 2.6.2 用于PCR的小量DNA的提取
• 2.7 对目的基因的PCR扩增
• 2.7.1 对目的基因BADH的PCR扩增
• 2.7.2 对目的基因mtlD的PCR扩增
• 2.8 分子杂交
• 2.8.1 试剂盒所应用的基本原理
• 2.8.2 试剂盒的成分
• 2.8.3 杂交中的注意事项
• 2.8.4 试剂和溶液的配制
• 2.8.5 Southern blotting
• 2.9 反转录PCR
• 2.9.1 总RNA的提取
• 2.9.2 RNA纯化
• 2.9.3 反转录
• 2.9.4 PCR扩增
• 2.10 转基因植株后代的遗传检测
• 2.11 耐盐试验
• 2.11.1 转基因材料东营种植选择
• 2.11.2 室内耐盐试验
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 转基因植株的获得
• 3.1.1 受体材料的选择和愈伤组织的诱导
• 3.1.2 抗性愈伤组织的筛选
• 3.1.3 转基因植株的再生
• 3.2 转基因植株的分子检测
• 3.2.1 转基因植株的PCR检测
• 3.2.2 转基因植株的Southern blotting
• 3.3 转基因后代的表达分析，即反转录
• 3.4 转基因植株后代的遗传检测
• 3.5 耐盐性分析
• 3.5.1 转耐盐基因（mtlD）旱稻的盐碱地种植选择
• 3.5.2 水培苗的各耐盐指标分析
• 第四章 结论
• 4.1 转基因植株的获得
• 4.2 转基因植株的耐盐性
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历