两株海洋来源真菌次级代谢产物研究

论文摘要

众所周知海洋占地球表面的三分之二,蕴藏着丰富的生物多样性,其特殊的高压、高盐、低温、缺氧、寡营养等条件,赋予了生存与海洋中的微生物生存环境、生理生化等的独特性,可能会产生结构新颖、活性多样的次级代谢产物,是新型药物先导化合物的重要来源。为了从海洋微生物次级代谢产物中寻找和发现新型抗肿瘤活性化合物,本论文对海洋来源的菌株进行了分离和抗肿瘤活性筛选,并采用了活性及化学追踪的方法对其中2株真菌中的活性成分进行了深入研究。主要研究内容如下:深海海泥及红树林植物根泥样品中微生物的分离与抗肿瘤活性的筛选;菌株发酵及次级代谢产物的提取分离;单体化合物的结构鉴定和活性评价。从采自广东湛江东海岛大桥和茂名电白县的红树林泥样及太平洋深海海域泥样等12个样品中共分离得到海洋微生物237株,其中真菌99株,放线菌138株。以小鼠白血病P-388肿瘤细胞为筛选模型,采用TLC法及HPLC指纹图谱等化学筛选手段对这些菌株进行筛选,并进一步结合SRB法进行体外抗肿瘤活性的一级、二级活性筛选,分别从广东省红树林植物根泥样品中获得代谢产物丰富、具有较强细胞增殖抑制活性的真菌5株、放线菌8株;从太平洋深海海域海底淤泥样品中,分离得到活性菌株真菌7株、放线菌5株。对以上12株活性真菌进行发酵条件摸索,以其中1株（HDN10421）红树林植物根泥来源的真菌作为主要研究对象进行大量发酵,系统研究其活性次级代谢产物。同时对深海来源真菌ZLN-29经ITS序列进行测序比对后,鉴定为青霉Penicillium sp.,并进一步对该菌进行了大规模发酵以及次级代谢产物成分的研究。对以上两株真菌的发酵浸膏运用薄层色谱、正相硅胶柱色谱、反相硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、反相高效液相等现代色谱学分离纯化手段,采用小鼠白血病肿瘤细胞株P388为筛选模型结合TLC及HPLC,进行活性及化学追踪分离。从Penicillium sp.ZLN-29的乙酸乙酯相中分离得到12个单体化合物（1-7, 13-17）,从红树林植物根泥来源真菌HDN10421的乙酸乙酯相中分离得到5个单体化合物（8-12）,共17个化合物。应用现代波谱学方法（UV、MS、NMR、IR等）和理化性质等阐述了其中11个化合物的化学结构（化合物结构参见Table 1）,其中从真菌Penicillium sp.ZLN-29的次级代谢产物中分离得到7个化合物,包括1个α,β-不饱和丁内酯类化合物Butyrolactone I（1）,2个聚酮类化合物（2、3）,3个大环聚酯类化合物（4、5、6）以及一个开环的类似物（7）;从红树林来源真菌HDN10421的次级代谢产物中分离得到4个化合物,包括2个混源萜类化合物（8、9）,以及2个甾醇类化合物（10、11）。采用SRB法,对化合物3-9进行了抗肿瘤活性的初步评价,结果显示化合物5-7对小鼠白血病P388细胞具有一定的细胞增殖抑制活性,其IC50分别为25.6,11.6,43.7μM,化合物8、9对人宫颈癌Hela细胞表现出较强的细胞增殖抑制活性,其IC50分别为7.4,2.2μM。综上所述,本文从红树林及深海海泥样品中共分离得到237株微生物,通过抗肿瘤活性筛选从中得到25株活性菌株（真菌12株,放线菌13株）;从其中一株红树林来源真菌以及Penicillium sp.ZLN-29的发酵产物中共分离得到17个单体化合物,阐明了其中11个单体化合物的结构,其中化合物8、9具有较强的抗肿瘤活性。上述研究,为抗肿瘤药物筛选提供了活性菌株及活性化合物,并为海洋生物资源的利用奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 海洋来源微生物的分离与活性筛选
• 第一节 海洋来源微生物的分离
• 第二节 活性菌株筛选模式
• 第三节 目标菌株的确定
• 第四节 结果与分析
• 第五节 讨论与小结
• 参考文献
• 第二章 深海来源真菌 Penicillium sp.ZLN-29 次级代谢产物的研究
• 第一节 化合物的结构鉴定
• 第二节 化合物表征
• 第三节 实验材料与方法
• 第四节 小结与讨论
• 参考文献
• 第三章 红树林来源真菌 HDN10421 次级代谢产物 研究
• 第一节 化合物的结构鉴定
• 第二节 化合物表征
• 第三节 实验材料与方法
• 第四节 小结与讨论
• 参考文献
• 第四章 实验部分
• 第一节 实验仪器、材料及试剂
• 第二节 活性的评价方法
• 第三节 培养基的配制
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 结语与创新点
• 个人简历
• 在学期间发表学术论文
• 致谢
• 附图