论文摘要
肽抗生素（peptide antibiotics）是近年来发现的生物体基因编码的具有抗微生物活性的小肽,通常是由12～60个氨基酸所组成,分子量﹤10kDa,是生物体天然免疫的重要组成部分。它作为一种新型的抗感染制剂,具有广谱、高效的杀菌活性,在传统抗生素耐药性问题日益严重的今天,已成为抗生素研发中的一个重要热点之一。在过去五年,围绕肽抗生素hPAB-β的研发工作中,我们已经基本形成了一条完整的生产工艺路线。肽抗生素hPAB-β是用简并引物从人皮肤角质形成细胞中克隆到的一人β型肽抗生素。在获得其碱基和氨基酸编码序列后,通过化学合成并复性,证实了其抗菌活性。然后根据其特性,我们设计并筛选到了一个承载分子PaP3.30（16.7kDa）,利用该分子能使hPAB-β融合蛋白在大肠埃希菌中的表达量达到菌体总蛋白的40%。然而,由于目标蛋白hPAB-β（4.3kDa）在整个融合蛋白分子（23.6kDa）中只占约1/6,其实际表达量占菌体总蛋白的比率（表达率）仅约7%,产量依然低下。为此,我们改用同尾酶法设计并构建了hPAB-β多拷贝串联体,并从得到的串联体基因工程菌中筛选出3拷贝最佳工程菌phPAB-β（3）/JM109,对其发酵条件进行了初步优化,并对表达产物进行纯化,确定了肽抗生素hPAB-β制备的工艺路线:工程菌发酵→高压匀浆破壁→包涵体提取→包涵体溶解→亲和层析纯化→羟胺裂解→反相层析纯化→复性→分子筛层析纯化→活性产物,最终得到了具有抗菌活性的目标肽抗生素hPAB-β。在上述制备工艺路线中,仍然存在一些问题,需要进一步优化和完善:①发酵工程菌phPAB-β（3）/JM109发酵后的细菌湿重最高只有39.2g/L,与理想的高密度发酵有一定差距。②在羟胺裂解反应中,存在着不同批次裂解产物的产量不稳定现象,需要优化,以实现目标蛋白产量最大化。此外,所制备的目的肽抗生素的抗菌活性如何?抗菌谱广否?有没有细胞毒作用?等等,也是我们所关心的。为此,我们开展了本课题的研究,主要研究内容和结果如下:
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标签：肽抗生素论文; 发酵论文; 蛋白表达率论文; 羟胺裂解论文; 反相层析论文; 抗菌活性论文; 金黄色葡萄球菌论文; 溶血活性论文; 细胞毒性论文;