论文摘要
人类心脏发育是一个错综复杂的过程,受一系列转录因子调控。目前虽然已经鉴定出很多心脏发育转录调控因子,但仍有很多心脏发育调控基因有待鉴定,其分子调控机制有待深入研究。ZNF382是我室克隆鉴定的一个人类心脏发育候选基因（登陆号NM 032825）,该基因在不同时期人类胚胎组织中广泛表达,在成人组织其表达限制在心脏,其表达特征提示ZNF382可能在心脏和肌肉发育和功能中起着潜在的调控作用。本文作者继续研究ZNF382在心脏和肌肉发育中的功能。RT-PCR实验结果表明,在C2C12细胞中诱导肌细胞分化后,其内源MHC和ZNF382的mRNA水平随诱导时间的延长而上调。报告基因转录活性分析表明,ZNF382单独不能激活MCK（MCK4800-luc）的转录活性,但能够与MyoD和E12共同激活MCK的转录活性,表明ZNF382是与MyoD和E12协同调控肌细胞的分化过程。为了鉴定ZNF382的相互作用蛋白,我们利用酵母双杂交技术,从成人心脏文库中筛选并鉴定出1个与ZNF382发生相互作用的蛋白MYL2。MYL2编码调控轻链相关心脏肌球蛋白β,提示ZNF382与MYL2可能共同参与心脏发育和功能的调控过程。我们首先利用亚细胞的定位实验研究ZNF382和MYL2在HEK293细胞中的定位情况。研究结果表明ZNF382定位于细胞核,MYL2在细胞核质中均有表达,当两者共同转入细胞时,MYL2蛋白大部分转移到了细胞核中,出现趋核现象,表明这两个蛋白在细胞内发生相互作用。为了进一步证明ZNF382和MYL2是否发生相互作用,我们通过免疫共沉淀实验进行验证。发现MYC标记的MYL2能被FLAG标记的ZNF382沉淀,而FLAG标记的ZNF382同样可以被MYC标记的MYL2沉淀,结果表明两者在体内确实存在相互作用。前人研究结果表明,MYL2是通过钙离子触发调节轻链的磷酸化,磷酸化后的MYL2反过来又触发肌肉的收缩状态。MYL2碱基突变能导致中左心室腔心室肥厚型心肌病。ZNF382和MYL2是否共同在左心室腔心室肥厚型心肌病发生中起调控作用,将是后续研究工作的一个重点。另外,我们还克隆了一个新的人类zf-CXXC结构的锌指基因CXXC5,该基因编码322个氨基酸,在物种进化上高度保守。RT-PCR分析表明CXXC5在成人及胎儿的组织中广泛表达。CXXC5定位于细胞核和细胞质中。在细胞过表达CXXC5使导致细胞核浓缩,提示该基因可能与细胞凋亡的发生有关。利用HEK293细胞系,我们首先通过流式细胞仪进一步检测CXXC5是否能促使细胞凋亡。结果表明,过表达CXXC5使细胞大量地停滞在G1前期。然后通过TUNEL法检测过表达CXXC5是否能使细胞出现细胞凋亡的表型,结果表明,瞬时过表达CXXC5的大部分细胞出现细胞凋亡的阳性结果,表明CXXC5确实与细胞凋亡的发生有关。为了研究CXXC5导致细胞凋亡的发生机制,我们利用报告基因系统和western blot研究CXXC5参与细胞凋亡的信号通路。根据细胞凋亡关键因子caspase的作用方式,细胞凋亡可分为受体途径和线粒体途径。WNF-a途径是受体途径的一种主要途径,又可分为死亡途径和促生存途径（JNK和NF-KB）。研究结果表明,过度表达CXXC5抑制p53的转录活性,但激活TNF-a转录的活性。在TNF-a下游途径中,过度表达CXXC5抑制c-jun,AP-1和NF-KB的转录活性,但激活caspase-8和caspase-3转录的活性,表明CXXC5是通过激活TNF-a的caspase途径调控细胞凋亡。