苏云金杆菌嵌合杀虫蛋白的构建与毒性分析

论文摘要

作为重要的杀虫微生物,苏云金芽胞杆菌（.Bacillus thuringiensis,简称Bt.）被越来越多的应用在生物防治与转基因领域,但是当今生物杀虫剂面临的一个最为重要的问题是农业害虫日益增长的抗药性。因此,开发出更多苏云金芽胞杆菌新型杀虫基因和寻找减缓昆虫抗性的方法,成为当今生物防治和转基因领域的热点。苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白（Vegetative Insecticidal Protein,简称VIPs）被誉为第二代生物杀虫剂,与传统上应用最为广泛的杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Protein,简称ICPs）相比,具有完全不同杀虫机理和杀虫谱。目前单独的VIPs和单独的ICPs转基因作物已经培育成功。然而,对于VIPs和ICPs两种蛋白协同使用的研究报道较少。鉴于此,本论文利用本室保存的一种密码子优化后的营养期杀虫蛋白基因vip3Aa7与其余几种优化后的cry杀虫晶体蛋白基因构建了几种新型的嵌合杀虫蛋白基因,并研究了杀虫活性,主要结果如下：1.Bt.嵌合杀虫蛋白植物表达载体及pCPANEK通用植物表达载体的构建利用增强子翻倍的CaMV35S启动子,TmvΩ和Kazak翻译增强序列以及PolyA识别剪切序列,PolyA尾序列以及Nos强终止子序列为表达元件,植物表达载体pCAMBIA2300为骨架构建出pCPANC1C, pCPANC2A, pCPANC9C单价植物表达载体,以及pCPANV3AC1C, pCPANV3AC2A, pCPANV3AC9C三种双价嵌合蛋白植物表达载体。利用上述表达元件和pCAMBIA2300载体,人工构建出一个通用性的植物表达载体pCPANEK,特点是在5’和3’表达框中间添加一段肠激酶切点（EK site）,可方便的直接构建双价嵌合蛋白,免除了分步克隆操作的繁琐。2.嵌合杀虫蛋白V3AC9C具有高效的杀虫活性,其毒力增加主要来自溶解度提高利用vip3Aa7与Cry1Ca,Cry2Aa,Cry9Ca等基因发明出一种嵌合蛋白的构建方法,将vip3Aa7基因置于5’端,保留N-半段cry基因置于3’端。构建出嵌合蛋白和各个单价杀虫蛋白使用带有GST标签的原核表达载体pGEX-6P-1在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中重组表达。结果表明：绝大部分蛋白在BL21中得到正确的表达。生物测定表明,使用Vip3Aa7和N-半段的Cry9Ca构建出的嵌合蛋白V3AC9C对小菜蛾具有非常高的毒力,半致死浓度（LC50）为0.322μg/mL,表达量为单价的N-半段Cry9Ca的61.3%。使用胰蛋白酶对V3AC9C进行切割激活,表明嵌合蛋白能被正确的切割成单独的Vip3Aa7的62kDa核心毒性片段和Cry9Ca的55kDa最终降解片段。将Vip3Aa7和N-半段Cry9Ca按照1：1质量比混合后作为对照,测定嵌合蛋白V3AC9C协同作用。发现V3AC9C的毒力甚至要高出混合毒素3.2倍。计算V3AC9C中Vip3Aa7和Cry9Ca的协同系数高达4.7,而混合毒素中的协同系数仅有1.5。溶解度分析和显微镜检测表明,在嵌合蛋白中Vip3Aa7可以帮助Cry9Ca溶解在碱性缓冲体系中,并证明嵌合蛋白V3AC9C的毒力增加主要来自于提高的溶解度。本次试验首次将Vip3A类蛋白与Cry类蛋白构建出嵌合蛋白,并且证明此种构建方式的可行性。构建出的嵌合蛋白V3AC9C高毒的特性和低表达量,使其可能成为一种非常有潜力的转基因材料。3.苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白Vip3Aa7半胱氨酸突变体的研究Bt.杀虫蛋白的毒性跟溶解度密切相关。生物信息学发现Vip3Aa7蛋白含有三个非常保守的半胱氨酸残基（Cys292,Cys401,Cys507）。为了研究这三个半胱氨酸残基对毒性的影响,利用定点突变技术,将这3个半胱氨酸残基替换成丝氨酸,以期待能够增加毒性。三个突变体表达后测定溶解度均比野生型有了一定的提高。但是生测结果表明,突变体毒力并未提高,而且C401S和C507S均完全丧失了毒性。进一步研究发现,突变体C292S,C401S和野生型的Vip3Aa7均可被胰蛋白酶正确消化成62kDa核心毒性片段,但C507S明显降解,由此推测出C507S毒力丧失是因为原因其对胰蛋白酶变得敏感。以上结果表明,Cys507对维持Vip3Aa7蛋白稳定具有重要作用。本次研究尝试虽未得到毒力增加的突变体,但为今后提高其他Bt.蛋白毒力提供了思路,为研究Vip3A蛋白杀虫机理也提供了新线索。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 縮略语表
• 1. 文献综述
• 1.1 苏云金芽胞杆菌简介
• 1.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白
• 1.2.1 杀虫晶体蛋白命名与分类
• 1.2.2 Cry类杀虫晶体蛋白性质
• 1.2.3 Cry杀虫晶体蛋白结构
• 1.2.4 杀虫晶体蛋白毒性机理
• 1.2.5 昆虫抗性与杀虫晶体蛋白受体之间关系
• 1.2.6 杀虫晶体蛋白Cry9Ca1性质
• 1.3 苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白
• 1.3.1 苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白分类
• 1.3.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白Vip3A结构与性质
• 1.3.3 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白Vip3A毒性机理
• 1.3.4 苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白Vip3Aa7性质
• 1.4 融合杀虫蛋白
• 1.4.1 多价杀虫蛋白的日的与优势
• 1.4.2 双价杀虫基因在转基因领域的应用方式
• 1.4.3 目前发明的抗虫多价融合蛋白
• 1.5 苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白毒力与溶解度的关系
• 1.5.1 杀虫晶体蛋白毒力与溶解度关系
• 1.5.2 营养期杀虫蛋白Vip3A毒力与溶解度关系
• 1.6 转基因抗虫植物
• 1.6.1 转基因是防治虫害的发展趋势
• 1.6.2 当前我国转基因研究实例
• 1.7 研究目的意义
• 2 材料方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 引物序列
• 2.1.3 培养基,抗生素及其培养条件
• 2.1.4 试剂与器材
• 2.1.5 供试昆虫
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 常规DNA操作
• 2.2.2 定点突变
• 2.2.3 蛋白异源表达,蛋白酶消化,SDS-PAGE及蛋白定量
• 2.2.4 异源表达杀虫蛋白包涵体的显微镜观察
• 2.2.5 杀虫蛋白毒力的生物测定
• 50和协同系数的计算'>2.2.6 杀虫蛋白半致死浓度LC₅₀和协同系数的计算
• 3 结果与分析
• 3.1 单双价杀虫蛋白植物表达载体的构建
• 3.1.1 pCPANV3AC2A双价嵌合植物表达载体构建
• 3.1.2 pCPANV3AC1C双价植物表达载体的构建
• 3.1.3 pCPANC1C,pCPANC2A单价植物表达载体的构建
• 3.1.4 pCPANEK通用植物表达载体的构建
• 3.1.5 pCPANEK通用植物表达载体特点和使用
• 3.2 单价,双价融合蛋白的构建,异源表达以及毒力分析
• 3.2.1 Cry1Ca,Cry2Aa,Cry9Ca,Vip3Aa7单价蛋白大肠杆菌原核表达载体的构建
• 3.2.2 V3AC1C,V3AC2A,V3AC9C双价嵌合蛋白大肠杆菌原核表达载体的构建
• 3.2.3 单双价蛋白的表达
• 3.2.4 杀虫蛋白异源表达包涵体的镜检
• 3.2.5 杀虫蛋白的胰蛋白酶消化
• 3.2.6 生物测定各杀虫蛋白毒力
• 3.3 苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白Vip3Aa7半胱氨酸突变体的毒力变化分析
• 3.3.1 Vip3Aa7蛋白的生物信息学分析
• 3.3.2 Vip3Aa7半胱氨酸残基定点突变及突变体的载体构建
• 3.3.3 Vip3Aa7半胱氨酸突变体蛋白的表达与溶解度分析
• 3.3.4 Vip3Aa7半胱氨酸突变体蛋白毒力的生物测定
• 3.3.5 胰蛋白酶对Vip3Aa7半胱氨酸突变体蛋白的消化测定
• 4 结论与讨论
• 4.1 嵌合蛋白构建方式的研究和定点突变
• 4.2 嵌合蛋白构建植物表达载体相对于传统双价载体的优势
• 4.3 嵌合蛋白被胰蛋白酶消化的研究
• 4.4 嵌合蛋白高毒力的分析
• 4.5 突变半胱氨酸对改造苏云金芽胞杆菌毒力的探讨
• 参考文献
• 已发表和待发表的论文
• 致谢