BADH基因、反义4CL基因对二色胡枝子的遗传转化研究

论文摘要

胡枝子（Lespedeza Michx.）是优良的水土保持和饲料型灌木,提高其抗逆性和饲用品质存农业、林业生产上具有重要意义。许多转基因成果表明外源甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因的导入可提高植物的抗旱、耐盐性。4-香豆酸-辅酶A-连接酶（4CL）是木质素合成过程中的关键酶,反义转入4CL基因可降低一些植物的木质素。木文选用BADH基因、反义4CL基因为目的基因,构建了以木糖异构酶（xylA）基因为标记基因的植物表达载体pBI121-xylA-BADH和无选择标记基因的双元植物表达载体反义4CL-BADH,期望通过转基因技术实现胡枝子木质素和抗逆性的遗传改良。试验材料选用生物量大,来自美国的二色胡枝子（Lespedeza bicolor Turcz.）为研究对象,优化了二色胡枝子的再生体系,建立了二色胡枝子遗传转化中的木糖选择系统和无标记基因选择系统,并将xylA-BADH基因、反义4CL-BADH基因转入到二色胡枝子之中,获得了转基因植株,并检测了转基因植株的部分功能。该项研究对促进转基因胡枝子的生产应用和胡枝子饲料产业的发展具有理论和现实意义。主要研究内容和结果如下:（1）从大肠杆菌基因组中克隆出了木糖异构酶基因xylA,构建了以木糖为选择剂的植物表达载体pBI121-xylA-BADH和无选择标记基因的双元植物表达载体反义4CL-BADH,并将这两个表达载体转化到根癌农杆菌中。（2）在二色胡枝子再生体系建立和优化过程中,确定了二色胡枝子培养过程中的基本培养基为大量元素浓度减半的MS培养基,命名为MS*。确定了二色胡枝子子叶节分化最适配方为:MS*+6-BA 1-0 mg.L-1+NAA 0.2 mg.L-1+蔗糖3%+琼脂6 g.L-1,茎段增殖适合配方为:MS*+6-BA 1.0 mg.L-1+NAA 0.1 mg.L-1+IBA 0.2 mg.L-1+蔗糖3%+琼脂6 g.L-1;生根最适配方为:MS*+NAA 0.1 mg.L-1+IBA 0.2 mg.L-1+蔗糖3%+琼脂6 g.L-1。（3）确定了二色胡枝子木糖选择系统和无标记基因选择系统的建立中头孢霉素的适用浓度,即:子叶节分化过程中为200～300 mg.L-1,茎段增殖和生根过程中为100 mg.L-1。当用木糖为选择剂进行pBI121-xylA-BADH遗传转化时,以3%的木糖取代蔗糖为子叶节不定芽分化过程中的选择剂,以0.5%的蔗糖和2.5%的木糖混合碳源作为抗性芽增殖和生根过程的选择剂。在反义4CL-BADH对二色胡枝子进行遗传转化研究中,确定了在培养基中添加1g.L-1的甜菜碱醛作为子叶节分化中的选择剂,培养基中添加0.3g.L-1的甜菜碱醛和0.7g.L-1的NaCl作为抗性芽增殖和生根过程的选择剂。（4）经过PCR、PCR-Southern和Southern检测,获得了转入xylA-BADH基因的二色胡枝子和转入反义4CL-BADH基因的二色胡枝子。耐盐性试验表明转入反义4CL单基因的二色胡枝子耐盐性最差,而转入xylA-BADH基因的二色胡枝子耐盐性最强,转入反义4CL-BADH双价基因的二色胡枝子耐盐性略次于非转基因材料。转入反义4CL-BADH基因的二色胡枝子组培苗经过1.0g.L-1NaCl胁迫培养,其甜菜碱醛脱氢酶活性可达对照材料的2.5倍。通过M（a｜¨）ule反应、Weisner反应、卢索夫法组织化学染色和木质素荧光观察,初步表明反义4CL-BADH基因的导入有可能降低二色胡枝子的木质素含量,并对检测方法的可靠性进行了讨论。此外,转入反义4CL-BADH的二色胡枝子茎段皮层组织中含有的异形细胞数量明显比对照多。通过对异形细胞、植物抗逆性、甜菜碱三者之间的关系讨论,认为转基因植株异形细胞数量多是由于BADH基因的导入可能合成了较多甜菜碱。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 本文缩略词
• 1 引言
• 1.1 胡枝子开发利用价值与遗传改良意义
• 1.2 植物木质素的生物合成与遗传调控
• 1.2.1 木质素的功能与组成
• 1.2.2 木质素生物合成途径
• 1.2.3 降低木质素含量与改变木质素单体组成的遗传调控
• 1.3 甜菜碱对植物抗逆性的影响及饲用价值
• 1.3.1 甜菜碱在植物中的代谢途径
• 1.3.2 甜菜碱的植物生理功能及对植物抗逆性的影响
• 1.3.3 甜菜碱的饲用价值
• 1.4 植物转基因中的安全性选择系统
• 1.4.1 糖类选择标记系统
• 1.4.2 化合物解毒酶基因标记系统
• 1.4.3 谷氨酸-1-半醛转氨酶基因标记系统
• 1.4.4 绿色荧光蛋白基因标记系统
• 1.4.5 消除选择标记基因
• 1.5 研究的主要内容与技术路线
• 2 植物表达载体反义4CL-BADH的构建及pBI121-xy1A-BADH的构建
• 2.1 实验材料与方法
• 2.1.1 基因、质粒和菌株
• 2.1.2 细菌培养基配方
• 2.1.3 酶和试剂
• 2.1.4 实验操作主要仪器
• 2.1.5 植物表达载体构建策略
• 2.1.6 细菌基因组DNA的提取
• 2.1.7 大肠杆菌质粒DNA的提取
• 2.1.8 目的基因xy1A、BADH的克隆和检测及35S-BADH-nos片段的克隆、检测
• 2.1.9 目的片段的纯化、回收
• 2.1.10 目的基因xy1A、35S-BADH-nos片段的末端添A及与pUCm-T、载体的连接
• 2.1.11 目的片段与质粒载体的酶切
• 2.1.12 目的片段与质粒子载体的连接
• 2.1.13 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.1.14 连接产物转化大肠杆菌
• 2.1.15 植物表达载体反义4CL-BADH、pBI121-xy1A-BADH转化农杆菌
• 2.1.16 PCR鉴定目的基因及测序
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 木糖异构酶基因xy1A的克隆及pBI121-xy1A载体的构建
• 2.2.2 甜菜碱醛脱氢酶基因BADH的克隆及pBI121-BADH载体的构建
• 2.2.3 35S-BADH-nos片段的克隆、pUCM-35s-BADH-nos载体的构建与测序
• 2.2.4 以木糖为选择剂的植物表达载体pBI121-xy1A-BADH的构建
• 2.2.5 无选择标记基因的植物表达载体反义4C1-BADH的构建
• 2.2.6 植物表达载体质粒pBI121-xy1A-BADH和反义4CL-BADH转化农杆菌
• 2.3 讨论
• 2.3.1 关于安全性多基因表达载体构建
• 2.3.2 用无标记基因表达载体进行植物遗传转化
• 2.4 小结
• 3 二色胡枝子高效再生体系的建立与优化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料与试剂
• 3.1.2 处理方法
• 3.1.3 培养基配方设计
• 3.1.4 数据分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 大量元素含量对二色胡枝子子叶节分化的影响
• 3.2.2 激素对二色胡枝子子叶节分化的影响
• 3.2.3 6-BA、NAA、IBA对二色胡枝子茎段增殖的影响
• 3.2.4 IBA、NAA、IAA对二色胡枝子不定芽生根的影响
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 4 农杆菌介导的二色胡枝子糖类遗传转化体系与无选择标记转化系统的建立
• 4.1 材料
• 4.1.1 材料与试剂
• 4.1.2 菌种与质粒
• 4.2 方法
• 4.2.1 二色胡枝子转化体系中抑菌剂浓度试验
• 4.2.2 二色胡枝子遗传转化体系中选择剂试验
• 4.2.3 影响二色胡枝子转化效果的因素筛选
• 4.2.4 遗传转化过程中培养基配方
• 4.2.5 农杆菌活化与培养
• 4.2.6 农杆菌介导的二色胡枝子遗传转化程序
• 4.3 主要仪器设备
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 二色胡枝子遗传转化中抑菌剂浓度优化
• 4.4.2 二色胡枝子遗传转化中选择剂研究
• 4.4.3 影响二色胡枝子转化效果的因素
• 4.5 讨论
• 4.5.1 植物遗传转化中的安全性选择标记基因及相应选择剂
• 4.5.2 农杆菌介导的遗传转化
• 4.6 小结
• 5 转基因植株的检测
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 试剂
• 5.1.3 主要仪器设备
• 5.1.4 试验方法
• 5.2 结果分析
• 5.2.1 转基因植株茎段增殖的选择剂抗性鉴定
• 5.2.2 转基因植株的PCR榆测
• 5.2.3 转基因植株的PCR-Southern检测
• 5.2.4 转基因植株的Southern检测
• 5.2.5 转基因植株的耐盐性试验
• 5.2.6 转反义4CL-BADH基因植株的组织化学染色
• 5.2.7 NaCl迫对转反义4CL-BADH基因植株的甜菜碱醛脱氢酶活性的影响
• 5.3 讨论
• 5.3.1 转基因植株的分子检测
• 5.3.2 关于转入反义4CL基因的功能检测
• 5.3.3 植物异形细胞与抗逆性
• 5.4 小结
• 6 讨论
• 6.1 关于胡枝子转基因的安全性问题
• 6.2 BADH基因的导入对植物的影响
• 6.3 反义4CL基因的导入对植物的影响
• 7 结论与展望
• 7.1 主要研究结论
• 7.2 展望
• 参考文献
• 附图
• 个人简介
• 导师简介
• 致谢