大豆脂氧酶催化过程的关键性问题研究及其产品的合成与应用

论文摘要

脂肪氧合酶（LOX）为活性中心含有铁的金属酶,能专一催化氧化含有cis,cis-1,4戊二烯不饱和结构的脂肪族化合物,通过分子内加氧形成含有共轭双键的氢过氧化衍生物。本文针对大豆LOX催化过程中的一些关键问题,例如外源金属离子对其催化过程的调控,外源Cu2+与酶活性中心Fe2+的置换,以及酶的热敏现象与其二级结构变化之间的关系进行了研究,加深了对LOX催化行为的理解。此外开发了一条利用脱脂豆粕为直接催化剂,在线偶联酶的提取和固定化的高效合成氢过氧化物的工艺,并研究了合成产物的性能及其进一步应用。首先研究了外源金属离子对大豆LOX的构象以及催化活性的影响。发现大豆LOX的催化活性对外源金属离子及其浓度的响应各异,其作用关系可以用Irving-Williams序列理论和Jahn–Teller效应来解释。并且利用新型指示剂对羧基偶氮安替比林和对羧基苯基荧光酮首次定量证明了外源Cu2+与LOX活性中心的Fe2+发生了置换。其次,为了深入分析LOX的热失活成因,研究了LOX的热失活动力学及其二级结构在变温下的CD与FT-IR光谱变化。研究发现在50-65 oC下,LOX的热失活遵循一级反应动力学,活化能Ea值为217 kJ?mol-1。与原生态LOX相比,升高温度使LOX结构中α-螺旋含量下降了约3%,β-折叠含量增加了约5%。但LOX的二级结构随加热时间的变化并不遵循一级反应,而是保持相对稳定;说明其二级结构的变化不是导致LOX失活的直接原因。进一步地,利用脱脂豆粕为直接催化剂,将LOX的提取、固定化和催化耦合于同一过程中,分别对亚油酸,亚油酸乙酯和豆油的催化氧化进行了系统研究。对影响反应的一些主要因素分别进行了考察与优化,最后分别以70%、55%和61%的产率得到相应的氢过氧化产物;远高于文献报道的亚油酸甘油酯的平衡产率（15%）。实验使用的脱脂豆粕较粗LOX的催化效率高,且能多次循环使用。此外,研究发现超声波介入可以减少催化剂用量至原来的15%并将反应时间缩短为原来的1/3。最后,研究了合成产物表面活性剂氢过氧化亚油酸钠（LA-HPOD-Na）和羟基亚油酸钠（LA-HOD-Na）的表面物化性能。LA-HPOD-Na对亚甲兰的漂除率最高达98%,漂白性能较常用氧漂剂过硼酸钠和过碳酸钠优越。由于亲水基团羟基的存在,LA-HOD-Na的表面张力较亚油酸钠高,乳化性能和分散性能较好。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 大豆脂氧酶的结构
• 1.2 大豆脂氧酶的底物及其选择性
• 1.2.1 天然游离不饱和脂肪酸类底物
• 1.2.2 改性的不饱和脂肪酸类底物
• 1.2.3 新型特殊底物
• 1.2.4 脂氧酶催化反应的选择性
• 1.3 脂氧酶的酶促反应及应用
• 1.3.1 固定化脂氧酶的酶促反应
• 1.3.2 非传统介质中的脂氧酶催化反应
• 1.3.3 脂氧酶酶促反应的应用
• 1.4 金属离子与金属酶的相互作用
• 1.4.1 金属酶的基团转移催化
• 1.4.2 金属离子与酶蛋白的结合位
• 1.4.3 二价金属离子与金属酶的相互作用
• 1.5 立题背景和研究内容
• 1.5.1 立题背景
• 1.5.2 主要研究内容
• 第二章 光谱法研究外源因素对脂氧酶的作用
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 试剂与仪器
• 2.2.2 UV 光谱和FS 光谱
• ²⁺和Fe²⁺浓度的测定'>2.2.3 游离Cu²⁺和Fe²⁺浓度的测定
• 2+和脂氧酶活性中心Fe（Ⅱ）的交换'>2.2.4 外源Cu²⁺和脂氧酶活性中心Fe（Ⅱ）的交换
• 2.2.5 脂氧酶的热稳定性测定
• 2.2.6 脂氧酶红外图谱的采集、处理和峰形拟合
• 2.2.7 CD 光谱
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 外源金属离子对脂氧酶紫外光谱的影响
• 2.3.2 外源金属离子对脂氧酶荧光光谱的影响
• 2.3.3 外源铜离子与脂氧酶的络合
• 2+络合物形成的动力学'>2.3.4 LOX-Cu²⁺络合物形成的动力学
• 2+与脂氧酶活性中心Fe²⁺的置换'>2.3.5 外源Cu²⁺与脂氧酶活性中心Fe²⁺的置换
• 2.3.6 脂氧酶的热失活动力学
• 2.3.7 FT-IR 光谱分析脂氧酶的二级结构
• 2.3.8 CD 光谱分析脂氧酶的二级结构
• 2.3.9 EDTA 对脂氧酶的影响
• 2.4 本章小结
• 第三章 豆粕（脂氧酶）好氧催化亚油酸及其酯的反应
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 试剂及仪器
• 3.2.2 油脂组分分析
• 3.2.3 豆粕和脂氧酶液的制备
• 3.2.4 分光光度法测定大豆脂氧酶的酶活
• 3.2.5 豆粕好氧催化亚油酸及其酯的釜式反应
• 3.2.6 豆粕的重复利用
• 3.2.7 豆粕好氧催化亚油酸及其酯的柱式反应
• 3.2.8 豆粕好氧催化豆油过程中脂氧酶的酶活
• 3.2.9 超声辅助豆粕（LOX）的催化反应
• 3.2.10 表面活性剂对脂氧酶催化大豆油反应的影响
• 3.2.11 金属离子对脂氧酶催化大豆油反应的影响
• 3.2.12 脂氧酶溶液的荧光光谱
• 3.2.13 氢过氧化亚油酸及其酯的含量测定
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 油脂筛选
• 3.3.2 溶剂筛选
• 3.3.3 柱径比
• 3.3.4 梯度加入豆粕对反应的影响
• 3.3.5 pH
• 3.3.6 反应进程
• 3.3.7 温度
• 3.3.8 底物浓度
• 3.3.9 豆粕浓度
• 3.3.10 豆粕与LOX 酶液催化效率的比较
• 3.3.11 豆粕的重复利用
• 3.3.12 压缩空气为氧源时豆粕催化豆油的反应
• 3.3.13 低豆粕量下LOX 酶促豆油的反应
• 3.3.14 豆粕好氧催化豆油的柱式反应
• 3.3.15 豆粕好氧催化皂化亚油酸的反应
• 3.3.16 超声辅助下脂氧酶催化反应动力学
• 3.3.17 表面活性剂对脂氧酶催化反应的影响
• 3.3.18 金属离子对脂氧酶催化反应的影响
• 3.4 本章小结
• 第四章 脂氧酶酶促反应产物的应用性能
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 试剂与仪器
• 4.2.2 LA-HPOD 热稳定性
• 4.2.3 LA-HPOD-Na 漂白亚甲蓝和叶绿素
• 4.2.4 特种污布的染制
• 4.2.5 LA-HPOD-Na 的漂白去污实验
• 4.2.6 氢过氧化亚油酸的还原
• 4.2.7 酸价
• 4.2.8 表面张力
• 4.2.9 乳化性能
• 4.2.10 泡沫性能
• 4.2.11 分散性能
• 4.2.12 Krafft 点
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 LA-HPOD 的热稳定性
• 4.3.2 LA-HPOD-Na 漂白亚甲兰
• 4.3.3 温度对LA-HPOD-Na 漂白亚甲兰的影响
• 4.3.4 pH 对 LA-HPOD-Na 漂白亚甲兰的影响
• 4.3.5 LA-HPOD-Na、PBS 和PCS 漂白亚甲兰
• 4.3.6 LA-HPOD-Na 漂白亚甲兰的动力学
• 4.3.7 LA-HPOD-Na、PBS 和PCS 漂白叶绿素
• 4.3.8 LA-HPOD-Na 与市售漂白产品的性能比较
• 4.3.9 LA-HPOD-Na 的复配体系
• 4.3.10 布基对漂白效果的影响
• 4.3.11 羟基亚油酸的制备
• 4.3.12 羟基豆油的制备
• 4.3.13 物化性能
• 4.4 本章小结
• 全文总结论
• 展望
• 主要创新点
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文