一、E.coli DNA抗肿瘤免疫的动态实验研究（论文文献综述）
尚可[1]（2021）在《肺癌源性吲哚胺2,3-双加氧酶1在T细胞耗竭中的作用及其抗癌免疫治疗的实验研究》文中提出研究背景:肺癌的发病率和死亡率已位居世界恶性肿瘤之首,目前,我国人群肺癌的术后复发率高,预后差,晚期患者5年生存率低于20%。肺癌已逐渐成为严重危害我国居民生命健康的常见及重要疾病之一。因此,寻找高效安全的预防治疗肺癌的方法一直是肿瘤研究的重大课题。近年来研究发现,肿瘤发生过程中,会伴随着一种T细胞功能的异常现象--T细胞耗竭（T cell exhaustion）,近期有研究结果提示:在黑色素荷瘤小鼠,会发生T细胞耗竭,其表现为抑制性受体PD-1上调,其分泌的细胞因子IL-2、TNF-α会减少。肿瘤的发生、发展是肿瘤细胞与免疫细胞之间相互对抗的过程,特别是T细胞起着很重要的作用,如果T细胞发生耗竭将会引起免疫功能减弱,肿瘤的免疫耐受以及导致肿瘤免疫治疗无效,因此深入探讨T细胞耗竭的特点及其相关机制将为肿瘤的免疫治疗提供新思路,不但有重要的理论意义,而且还有较强的应用价值和临床意义。吲哚胺2,3–双加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO）IDO是机体内重要的内源性免疫负调控分子,IDO是细胞内一种含亚铁血红素的酶,是肝外唯一催化色氨酸沿犬尿氨酸途径分解代谢的限速酶,在维持机体免疫稳态、移植耐受、肿瘤局部免疫抑制微环境的形成,以及介导肿瘤的免疫逃逸中发挥了十分重要的作用。Munn等研究发现,IDO1不仅表达于肿瘤相关细胞,如DC、巨噬细胞、内皮细胞,而且高表达于肿瘤细胞。Que Z等研究发现,IDO1在小鼠的非小细胞肺癌中表达,通过增加IDO1的表达,促进Treg细胞增加,从而产生免疫抑制。Mittal,R等在小鼠肺癌实验中研究发现,肺癌小鼠的CD4+T细胞、CD8+T细胞中抑制性受体PD-1,BTLA的表达比正常小鼠的高,且肺癌小鼠CD8+T细胞分泌的细胞因子IFN-γ、IL-2比正常小鼠的低。Cara C.Schafer等在小鼠肺癌模型的研究发现,基因敲除IDO-/-的肺癌小鼠能降低肿瘤大小,降低肿瘤浸润的CD4+、CD8+T细胞耗竭的PD-1的表达,说明IDO缺失能抑制T细胞的耗竭。前期有研究发现,DC中的IDO1高表达会升高PD-1、TIM-3、BTLA的表达,引起T细胞耗竭,沉默DC中的IDO1会下调T细胞耗竭相关的抑制性受体,减少T细胞耗竭,且肿瘤细胞中的IDO1高表达能抑制T细胞的细胞毒性作用,促进Treg细胞的产生,那么肿瘤中IDO1与耗竭性T细胞是否相互影响?肿瘤中的IDO1高表达是否促进T细胞耗竭,都是值得探讨的问题。目前关于IDO1与肿瘤的相关研究主要集中在肿瘤免疫耐受方面,而肿瘤环境中IDO1与耗竭性T细胞的关系报道甚少,肺癌中的IDO1是高表达的。本研究将构建IDO1低表达的肺癌细胞株与耗竭性T细胞共培养,研究IDO1表达与T细胞耗竭的作用;体内用IDO1高表达的肺癌细胞株接种小鼠,建立肺癌荷瘤小鼠模型,再用IDO1-sh RNA治疗荷瘤小鼠,观察其T细胞耗竭及肿瘤生长情况。综上所述,我们提出以下假设:（1）肺癌细胞中的IDO1高表达会导致T细胞抑制性受体PD1、BTLA的过表达,从而导致T细胞耗竭、促进肿瘤的发生。（2）体内肿瘤中IDO1低表达,可以抑制T细胞耗竭,重新建立抗肿瘤免疫,从而抑制肺癌的生长。本研究将从以下几个方面进行:（1）肺癌源性IDO1在耗竭性T细胞中的作用;（2）肺癌中IDO1低表达抑制T细胞耗竭及肿瘤生长的体内实验研究,观察瘤源性IDO1对耗竭性T细胞的生物学特性,从而进一步探讨肺癌中的IDO1在T细胞耗竭中的作用机制,为肺癌的免疫治疗提供靶向依据。第一部分肺癌源性IDO1在耗竭性T细胞中的作用的体外实验研究目的:应用RNA干扰（RNA interfering,RNAi）技术沉默吲哚胺2,3双加氧酶1（IDO1）,观察IDO1-si RNA对Lewis肺癌细胞株（Lewis lung cancer cells,LLC）的IDO1沉默效果;验证肺癌细胞中IDO1表达下调对T细胞耗竭的影响。方法:采用IDO1-si RNA沉默LLC细胞中的IDO1的表达后,通过实时荧光定量PCR法检测IDO1m RNA的表达变化,Western-blot法检测IDO1蛋白的表达变化;建立了肺癌LLC荷瘤小鼠模型,从小鼠的淋巴结中分离了T细胞,再分别和IDO1-si RNA处理的LLC细胞、Gl2-si RNA处理的LLC细胞和未处理的LLC共培养,检测T细胞的增殖和凋亡情况,耗竭性T细胞的抑制性受体PD-1和BTLA的表达。结果:实时荧光定量PCR和Western blot结果显示,IDO-si RNA转染LLC细胞后,IDO1 m RNA和蛋白的表达明显降低;IDO1-si RNA处理的LLC和T细胞共培养,T细胞增殖能力相对于阴性对照Gl2-si RNA组显着增加（Gl2-si RNA:74.4±1.5,IDO1-si RNA:82.5±2.3）,凋亡能力显着降低（Gl2-si RNA:73.63±1.85,IDO1-si RNA:13.83±1.34）。IDO1-si RNA处理的LLC和T细胞共培养组中的CD8+T细胞的抑制性受体PD-1和BTLA（PD?1:8.37±1.17%;BTLA:5.06±0.47%）的表达明显低于和Gl2-si RNA处理的LLC细胞共培养组（PD?1:15.8±1.18%;BTLA:7.34±1.02%）和未处理的LLC细胞共培养组（PD?1:16.8±2.3%;BTLA:7.83±1.07%）。结论:体外通过RNA干扰（RNA interfering,RNAi）技术沉默IDO1的表达切实可行,在体外沉默了LLC细胞中的IDO1的表达能抑制T细胞的凋亡,促进T细胞增殖,并且抑制了T细胞的耗竭。第二部分肺癌中IDO1低表达抑制T细胞耗竭及肿瘤生长的体内实验研究目的:研究IDO1敲低对肺癌荷瘤小鼠T细胞耗竭的作用及对其肿瘤生长的影响。方法:建立了LLC肺癌荷瘤小鼠模型后,通过流式细胞术检测肺癌荷瘤小鼠和非肿瘤小鼠淋巴结和脾脏中的CD4+、CD8+T细胞含量以及T细胞耗竭抑制性受体PD-1和BTLA表达情况,ELISA法检测细胞因子TNF-α和IL-2的分泌,然后使用IDO1-sh RNA、Scramble-sh RNA质粒尾静脉注射入荷瘤小鼠体内进行肿瘤治疗,免疫组化检测各处理组肺癌荷瘤小鼠IDO1的表达差异,游标卡尺测量肿瘤的大小,天平称量肿瘤的重量;再通过流式细胞术、ELISA法检测淋巴结和脾脏中的CD4+、CD8+T细胞耗竭的抑制性受体PD-1和BTLA表达情况,以及细胞因子TNF-α和IL-2的分泌情况。结果:相比正常小鼠模型,肺癌荷瘤小鼠能增加CD4+、CD8+T细胞PD-1、BTLA的表达;肺癌荷瘤小鼠经给予IDO-sh RNA治疗后,与Scramble-sh RNA、Control组相比,IDO1-sh RNA治疗组的肿瘤生长速度显着减慢、肿瘤显着减小、肿瘤的重量显着减轻;体内IDO1-sh RNA沉默IDO1的表达抑制了CD4+、CD8+T细胞PD-1、BTLA的表达;体内IDO1-sh RNA治疗肺癌荷瘤小鼠,其细胞因子TNF-α和IL-2的分泌增加,且能恢复到正常小鼠（非肿瘤）的TNF-α和IL-2的分泌量。结论:尾静脉注射IDO1-sh RNA可抑制肺癌荷瘤小鼠的肿瘤的生长,其机制可能是通过抑制T细胞耗竭途径。
殷慧慧[2]（2021）在《第一部分：基于胆汁DNA中突变和甲基化的平行分析建立胆胰系统恶性肿瘤辅助诊断模型 第二部分：肠道微生物中有益菌群与晚期胸部肿瘤患者接受抗PD-1免疫治疗疗效相关性的研究》文中指出目的:本研究基于胆汁DNA中突变和甲基化的平行分析,拟建立胆胰系统恶性肿瘤辅助诊断模型,为目前临床中经内窥镜逆行胰胆管造影术（ERCP）诊断结果不明确的患者提供辅助性诊断的方法,从而提高胆胰系统疾病中恶性肿瘤的检出率,使患者能更及时、准确的就诊,提高患者的治愈率及生存水平。内容:本研究共采集来自5家医院的259例胆汁样本,通过提取胆汁中DNA并分析DNA的基因突变和甲基化差异,结合临床的诊断结果,建立并优化胆胰系统恶性肿瘤辅助诊断模型（Bilescreen）,并在测试数据集中对ERCP诊断结果不明确的患者进行恶性肿瘤的检测及灵敏度和特异度分析。同时将Bilescreen的检测结果,相应患者的血清CA19-9的检测结果以及两者联合的检测结果对胆胰系统良恶性疾病的诊断能力进行比较。另外,本文还对部分患者胆汁样本中微生物的分布情况进行研究,分析微生物菌群分布与胆胰系统良恶性疾病的相关性。方法:收集胆胰系统疾病患者的胆汁样本,分为训练数据集、验证数据集和测试数据集,分别提取胆汁样本中的DNA,以qPCR技术对胆汁DNA所含人源DNA和细菌DNA进行定量检测。对于人源DNA含量较高的样本,利用Mutation Capsule的实验方法进行二代测序文库构建,分析胆汁DNA中基因突变和甲基化的测序结果;通过分析训练数据集中基因突变和甲基化差异与临床诊断为胆胰系统良恶性疾病的患者相关性,建立胆胰系统恶性肿瘤辅助诊断模型（Bilescreen）,将Bilescreen在验证数据集中进行参数优化,在测试数据集中进行恶性肿瘤辅助诊断。同时收集患者的血清CA19-9的检测结果,根据患者的临床信息分析比较血清CA19-9、Bilescreen的检测结果对这部分患者的诊断的灵敏度和特异度。对于胆汁中细菌DNA含量较高的样本,使用16S rDNAV4扩增子测序技术对胆汁中细菌DNA的V4区域进行扩增以及二代测序,根据测序结果分析微生物菌群在胆胰系统疾病患者胆汁中的分布,比较菌群分布与胆胰系统良恶性疾病的相关性。成果:在训练数据集样本中,血清CA19-9与Bilescreen中基于胆汁DNA的突变和甲基化检测诊断恶性肿瘤的灵敏度相当,分别是88.10%和90.48%;Bilescreen中基于胆汁DNA的突变检测诊断恶性肿瘤的特异度为100%,DNA突变结合甲基化检测诊断恶性肿瘤的特异度为97.56%,而血清CA19-9检测的特异度只有65.85%。在ERCP不能明确诊断的测试数据集样本中,Bilescreen中基于胆汁DNA的突变和甲基化检测恶性肿瘤的灵敏度为83.87%,特异度为85.71%,而血清CA19-9对恶性肿瘤诊断的灵敏度为83.87%,但特异度仅有14.29%。在胆汁微生物分析中,本研究发现胆胰系统良性疾病患者组中主要存在的细菌门是厚壁菌门（Firmicutes）,在胆胰系统恶性肿瘤患者组中主要存在的细菌门是变形菌门（Proteobacteria）。这两种主要的细菌门在良恶性组别患者中的分布未见显着差异（p=0.267和p=0.215）。在细菌科的差异分析中,本研究发现6种细菌科显着富集于胆胰系统恶性肿瘤患者组样本中,分别是气单胞菌科（Aeromonadaceae,p=0.019）,毛螺菌科（Lachnospiraceae,p=0.030）,微杆菌科（Microbacteriaceae,p=0.045）,紫单胞菌科（Porphyromonadaceae,p=0.030）,普雷沃氏菌科（Prevotellaceae,p=0.045）和韦荣氏菌科（Veillonellaceae,p=0.045）。结论:本研究通过对胆汁中DNA进行二代测序分析,构建基于胆汁DNA中基因突变和甲基化检测的胆胰系统恶性肿瘤辅助诊断模型,在两个维度上对于胆胰系统恶性肿瘤进行诊断预测,其诊断能力与目前临床中常规的诊断结果相当。本方法还可以对ERCP不能明确诊断的患者进行有效的恶性肿瘤辅助诊断,或有望在今后的临床的辅助诊断中得到应用。同时,本研究还在胆胰系统恶性肿瘤患者胆汁中发现特异的细菌科,说明胆胰系统良恶性疾病患者胆汁中微生物的分布存在差别,该指标有望作为另一个维度的生物学标记物,提高对胆胰系统良恶性疾病的诊断水平。目的:本研究通过测序分析抗PD-1免疫抑制剂治疗晚期胸部肿瘤患者的有效组和无效组基线粪便样品中的肠道菌群差异,探讨了在抗PD-1免疫抑制剂治疗过程中患者基线粪便样品中肠道菌群差异与免疫治疗疗效之间的关系。期望以患者基线粪便样品中与抗PD-1免疫抑制剂治疗疗效相关的差异菌种作为生物标记物,在治疗前预测免疫治疗疗效,使更多患者从免疫治疗中获益。内容:本研究探讨了在晚期胸部肿瘤患者抗PD-1免疫抑制剂治疗过程中,基线粪便样品中肠道菌群与免疫治疗疗效之间的关系。首先收集在接受抗PD-1治疗的晚期胸部肿瘤患者的基线以及治疗期间的粪便样本,通过提取粪便样本中细菌DNA、建立16S rDNAV4扩增子文库,并进行16S rDNAV4测序;通过对测序结果分析治疗有效组患者和治疗无效组患者基线和治疗期间的粪便样品中肠道菌群Alpha多样性和Beta多样性方面的区别以及肠道菌群的分布情况,并进一步确定两组患者肠道菌群在细菌科水平的差异菌种;结合临床资料分析患者免疫治疗的疗效与差异菌种的相关性。方法:本研究入组42名接受抗PD-1治疗的晚期胸部肿瘤患者,收集患者的基线以及治疗期间的粪便样本,提取粪便样品中细菌DNA并构建16S rDNA V4扩增子文库进行二代测序。以测序结果分析治疗有效组患者和治疗无效组患者基线和治疗期间粪便样品中肠道菌群在Alpha多样性和Beta多样性方面的区别,以及两组患者肠道菌群在细菌门水平和细菌科水平的组成成分的差异。使用客观反应率、疾病控制率作为近期疗效,疾病无进展期和总生存期作为远期疗效,评估基线肠道菌群中菌种差异对患者的临床治疗效果的影响。采用单因素分析和多因素回归分析对患者免疫治疗的疾病无进展期有影响的肠道菌群和临床资料特征。结果:免疫治疗有效组患者（n=23）和无效组患者（n=19）的基线便样品中肠道菌群在Alpha多样性和Beta多样分析中无显着性差异。在基线便样品中肠道菌群的细菌门水平的分析中,主要分布的细菌门类是厚壁菌门（Firmicutes）,拟杆菌门（Bacteroidetes）,变形杆菌门（Proteobacteria）和放线杆菌门（Actinobacteria）,两组患者在细菌门类的分布没有显着差异。在细菌科水平的分析中,免疫治疗有效组患者的基线便样品中有5类细菌科的相对丰度显着高于免疫治疗无效组,它们分别是阿克曼菌科（Akkermansiaceae）,肠杆菌科（Enterobacteriaceae）,梭菌目分类下的Family Ⅺ科（Clostridiales family XI）,肉杆菌科（Carnobacteriaceae）,肠球菌科（Enterococcaceae）。以这5类细菌科作为一个共生菌混合物,可有效的区分有效组患者和无效组患者（p=0.014）,且患者在免疫治疗前具有更高丰度的该类共生菌混合物时疾病无进展期显着延长（p=0.00016）。多因素回归分析显示,基线便样品中肠道菌群共生菌混合物的丰度是影响晚期胸部肿瘤患者抗PD-1免疫治疗的中位疾病无进展生存期的独立风险因素（HR=0.17,95%CI为0.05-0.55,p=0.003）。另外,在免疫治疗期间患者肠道菌群中共生菌混合物的丰度是存在一定波动的,但是其变化未见显着差异（p=0.878）。结论:晚期胸部肿瘤患者治疗前的便样品中肠道菌群组成成分及其丰度对抗PD-1免疫治疗有重要影响。基线肠道菌群中共生菌混合物（即阿克曼菌科,肠杆菌科,梭菌目分类下的Family XI科,肉杆菌科,肠球菌科）有望成为晚期胸部肿瘤患者进行抗PD-1免疫治疗疗效预测的生物标记物,通过检测其丰度可对抗PD-1免疫治疗疗效进行有效预测。
谢辉[3]（2021）在《基于肠道菌群与代谢组学的消癌解毒方抗结肠癌的机制研究》文中进行了进一步梳理目的:1.通过建立结肠癌模型探究消癌解毒方抗结肠癌疗效2.通过分析结肠癌小鼠肠道菌群及血清代谢物探究消癌解毒方抗结肠癌机制。方法:首先建立HCT116移植瘤模型,对照组予生理盐水灌胃、消癌解毒方组按低、高剂量灌胃。期间观察小鼠活动状态,测小鼠体重及瘤体积。灌胃结束后取肿瘤组织称重并计算抑瘤率,取肝脏、脾脏、肾脏组织称重,计算脏器系数。行HE染色观察消癌解毒方对病理组织的影响,取小鼠粪便进行16SrDNA测序分析。建立伪无菌HCT116结肠癌小鼠模型,对照组予生理盐水灌胃、消癌解毒方组按低、高剂量灌胃。测小鼠瘤体积及瘤重计算抑瘤率。取HCT116移植瘤小鼠血清行HPLC-MS技术分析,筛出差异代谢物及作用通路。结果:1.消癌解毒方抗结肠癌效果显着,低剂量组抑瘤效果优于高剂量组,且对小鼠体重、肝脏、脾脏、肾脏系数无显着影响。2.消癌解毒方可以提高拟杆菌门、拟杆菌科、拟杆菌属、普雷氏菌科、Parabacteroidesdistasonis等菌的丰度,降低条件致病菌厚壁菌门、放线菌门、脱硫弧菌属、肠杆菌属、脱铁杆菌科等菌的丰度。3.缺乏正常肠道菌群条件下,消癌解毒方对HCT116移植瘤的增长无明显抑制作用。4.消癌解毒方可以上调次黄嘌呤、黄嘌呤、甘氨酸、精氨酸、瓜氨酸、丙氨酸、α-亚麻酸、溶血性磷脂胆碱等代谢物。下调亚油酸、胆红素、花生四烯酸、抗坏血酸、芥子酸、胆酸、脱氧胆酸、5-羟甲基尿嘧啶等代谢物。5.消癌解毒方抗结肠癌过程中主要涉及以下代谢途径:氨基酸的生物合成、初级胆汁酸合成、脂质途径、脂多糖途径、HIF-1信号通路、甘氨酸及精氨酸代谢、磷酸戊糖途径、α-亚麻酸代谢、嘌呤代谢、嘧啶代谢、脂肪酸代谢、次级胆汁酸合成等途径。结论:消癌解毒方依赖肠道菌群发挥抗结肠癌作用。消癌解毒方可以增加拟杆菌门、拟杆菌科、拟杆菌属、普雷氏菌属、Parabacteroidesdistasonis丰度,减少条件致病菌肠杆菌属、脱硫弧菌属及葡萄球菌属的丰度。消癌解毒方可能通过调节特定菌种如放线菌门、变形菌门、软壁菌门、拟杆菌属、普雷沃氏菌属、Alloprevotella来干预肠癌小鼠的氨基酸代谢、脂质代谢、脂肪酸代谢、HIF-1信号通路,增强机体免疫力、减轻炎症、促凋亡等多种途径共同作用达到抗肿瘤效果。
李艳华[4]（2020）在《功能纳米生物复合物用于癌症免疫治疗》文中指出癌症的免疫治疗是继传统手术、放疗、化疗之后的一种革命性的癌症治疗方法,它将人们的思维方式从直接摧毁癌细胞转变为通过激活宿主的抗肿瘤免疫反应来识别和攻击癌细胞。许多触发免疫反应的免疫调节剂被开发并应用于癌症免疫治疗。但是,直接将常见的免疫调节剂注射到人体内,容易引起过度的免疫反应,危害极大。因此,开发诱导可控免疫反应的功能型的免疫调节剂,对癌症免疫治疗具有重要意义。纳米技术为开发功能型的免疫调节剂提供了良好的基础。与传统的纳米医学相比,纳米给药系统在癌症免疫治疗方面有以下优势。1)人们可以根据需要将药物运送到容易被纳米颗粒靶向的免疫细胞和免疫组织中。2)可以通过修饰纳米药物载体来调节纳米颗粒与免疫细胞或免疫器官之间的相互作用。3)纳米药物载体可以改善药物的药理特性,防止药物的过早释放和降解。4)纳米颗粒可以被设计成特异性响应的纳米药物载体,实现纳米颗粒的靶向给药,减少脱靶毒性。5)纳米颗粒的靶向给药,结合可控和局部药物释放,可以实现免疫检查点抑制剂的剂量节省或仅在预期的作用部位激活免疫疗法,从而减轻免疫疗法非特异性的安全隐患。综上所述,发展基于纳米材料的功能性的纳米免疫调节剂,用于提高癌症的免疫治疗效果,降低治疗过程中的毒副作用是非常有前景的。本论文基于碳酸钙、DNA四面体、二氧化硅、金属有机框架等多种纳米材料,设计并制备了一系列具有生物相容性的功能纳米生物复合物用于提高癌症的免疫治疗效果,具体包括:1.发展了一种肿瘤酸性响应、钙离子协同的纳米免疫制剂协同促进T细胞的激活并增强癌症免疫治疗。当纳米免疫制剂到达酸性的肿瘤微环境时,碳酸钙纳米材料分解释放出免疫刺激剂（Cp G ODNs和IDOi）和钙离子。Cp G ODNs负责激活树突细胞成熟进而增加免疫原性激活T细胞。IDOi能抑制色氨酸到犬尿氨酸的催化氧化过程,从而防止T细胞的衰老和凋亡。由于免疫抑制微环境的复杂性,仅仅抑制一条免疫抑制的通路很难实现T细胞的重新激活。幸运的是,释放出的钙离子可以促进T细胞的激活和增殖,进而与免疫刺激剂协同作用确保强烈、持续的免疫响应的发生。活体实验表明,我们设计的钙离子协同的纳米免疫制剂可以明显地抑制肿瘤的发展并由于长时间的记忆效应防止肿瘤的复发。这种免疫治疗的策略为临床治疗肿瘤并防止其复发提供了可能性。2.发展了一种功能化的DNA四面体纳米免疫调节剂来特异性触发内质网应激以增强癌症的免疫治疗。纳米免疫调节剂可以通过与磺胺受体结合定位到癌细胞的内质网中。然后葡萄糖的消耗和活性氧（ROS）的产生会引起强烈的内质网应激反应,诱导免疫原性细胞死亡（ICD）暴露肿瘤免疫原,促进树突细胞成熟,刺激T细胞的增殖和浸润,进而强化肿瘤免疫治疗的效果。具备触发内质网应激功能的纳米免疫调节剂与免疫检查点抑制剂（α-PD-1）联合使用,对乳腺癌和黑色素瘤有显着抑制作用。3.发展了一种类似树突细胞的仿生纳米颗粒（DMSNs3@HA）,通过协同激活T细胞并打破其免疫“刹车”来改善免疫治疗的效果。DMSNs3@HA由树枝状介孔二氧化硅纳米颗粒作为纳米载体,抗CD3和抗CD28模拟树突细胞来激活T细胞,抗PD-1阻断PD-1/PD-L1的通路,透明质酸特异性靶向肿瘤组织。当静脉注射时,同时具备T细胞激活剂和免疫检查点抑制剂的DMSNs3@HA可以通过调控T细胞的行为引发强烈的抗肿瘤免疫响应,达到“1+1>2”的治疗免疫抑制型肿瘤的效果。这种具有生物相容性、肿瘤靶向和类似树突细胞的仿生纳米颗粒有望推进免疫抑制肿瘤的免疫治疗。4.发展了一种基于金属有机框架材料的化疗联合免疫治疗的策略用于乳腺癌的治疗。ZIF（DAC）-DOX中的阿霉素引起癌细胞发生ICD,进而引发三磷酸腺苷（ATP）的大量释放。在酸性和ATP存在的环境中,ZIF瓦解,其内部的亚胺键在酸性的肿瘤微环境中断裂,释放出地西他滨逆转癌细胞DNA甲基化,促进肿瘤的化疗。另外,发生ICD的癌细胞释放出大量的免疫原激起机体的免疫响应,从而招募更多的T细胞到肿瘤组织处,此时游离的地西他滨可以逆转T细胞的DNA甲基化,缓解T细胞耗竭和无能的状态。结合免疫阻断抑制剂,其引发的免疫响应预计可以对远端的肿瘤有非常好的抑制效果。
宗帅[5]（2020）在《粒毛盘菌多糖抗肿瘤作用及其机制研究》文中指出前期,本课题组已经对粒毛盘菌YM130胞外多糖（LEP130）的结构进行了解析,并发现了LEP130的抗肿瘤活性。然而其抗肿瘤作用机制尚不清楚。本文研究了LEP130的抗肿瘤作用及其与化疗药物的协同作用,并对其作用机制进行了初步的探讨。主要研究结果如下:1)利用体外实验研究了LEP130与5-氟尿嘧啶（5-FU）联用对Hep G2细胞的抑制作用。MTT实验结果表明,LEP130与5-FU联用对Hep G2细胞活性具有显着的抑制作用,该抑制作用强于LEP130或5-FU单独处理,并且两者间具有显着的协同作用。而LEP130对人皮肤成纤维细胞HSF、人正常肝细胞LO2没有明显作用,这表明LEP130对正常细胞是安全无毒的。Western blot等实验结果表明,LEP130能降低胸苷酸合酶和二氢嘧啶脱氢酶的表达,从而抑制5-FU的降解失活。另外,LEP130能抑制Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt/m TOR介导的细胞存活通路,增强Hep G2细胞对5-FU的敏感性,防止细胞产生耐药性。LEP130还能抑制Nrf2介导的细胞抗氧化防御系统,增加细胞内活性氧,并破坏线粒体膜电位,激活线粒体凋亡途径。还发现,LEP130能促进p53活化,抑制NF-κB及其下游靶蛋白的表达,导致细胞周期停滞在S期,并且抑制DNA碱基切除修复和错配修复,继而增强5-FU的作用效果。因此,LEP130与5-FU通过多种方式发挥体外抑制Hep G2细胞的协同增效作用。2)采用H22荷瘤小鼠模型,研究了LEP130与环磷酰胺（CTX）对H22肿瘤生长的抑制作用。结果表明,LEP130能激活Fas/Fas L介导的死亡受体途径,增加相关蛋白（如caspase 3、caspase 8、PARP1等）的表达,并通过t-Bid激活线粒体凋亡途径。LEP130还能通过抑制血管生成相关蛋白（如VEGF、b FGF、MMPs等）的表达,减少瘤内血管生成。此外,LEP130能提高H22荷瘤小鼠的脾脏指数和胸腺指数,促进T细胞、NK细胞和巨噬细胞向肿瘤组织中浸润,增加血清和肿瘤组织中免疫因子（IFN-γ、IL-1β、IL-2和TNF-α）的含量,继而激活抗肿瘤免疫系统抑制肿瘤的生长。还发现,LEP130能抑制Stat3和NF-κB介导的细胞存活蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL、Survivin等）的表达,并抑制H22肿瘤细胞产生多药耐药性,继而增强CTX的抑瘤作用。同时发现LEP130能显着改善由CTX导致的肝损伤、肾损伤、免疫抑制等副作用,促进机体恢复健康。以上结果表明,LEP130与CTX联用能协同抑制H22荷瘤小鼠肿瘤的生长,并且LEP130能缓解CTX引起的副作用。3)利用S180荷瘤小鼠模型,研究了LEP130对抗肿瘤免疫系统的作用。体外实验表明LEP130不能抑制S180细胞的增殖,而体内实验证实LEP130能显着抑制S180荷瘤小鼠肿瘤的生长。实验结果表明,LEP130主要通过激活机体免疫系统来发挥抑瘤作用。对S180荷瘤小鼠进行灌胃处理后发现,LEP130能引起辅助性T细胞向Th1型极化,并促进Th1细胞因子（IL-2和IFN-γ）的表达;抑制辅助性T细胞向Th2型极化,并抑制Th2细胞因子（IL-4和IL-10）的表达。另外,LEP130引起的高水平的IFN-γ被证明能调节肿瘤微环境中的巨噬细胞分型,促进巨噬细胞向M1型极化,继而发挥抑瘤作用。此外,LEP130能通过增加抑瘤性免疫细胞（如白细胞、B细胞和NK细胞等）和抑瘤性免疫细胞趋化因子（如CXCL9、CXCL10和CXCL13等）,抑制免疫抑制性细胞（如骨髓源性抑制细胞、调节性T细胞等）、免疫抑制细胞趋化因子（如G-CSF、M-CSF、CCL22等）以及免疫抑制因子（如TGF-β、IL-10、PEG2等）,改善免疫抑制性肿瘤微环境,增强免疫系统对肿瘤细胞的杀伤作用。最后,体外实验表明,LEP130能通过TLR4介导的NF-κB信号通路直接诱导原代巨噬细胞向M1型转化,发挥抑瘤作用。以上结果表明,LEP130能激活机体免疫系统抑制S180荷瘤小鼠肿瘤的生长。4)采用AOM/DSS诱导的小鼠结肠癌模型,研究了LEP130对结肠癌的抑制作用以及对肠道菌群的影响。LEP130能显着缓解AOM/DSS导致的结肠癌小鼠体重减轻、结肠长度缩短,并有效抑制了结肠肿瘤的发生。另外,LEP130能显着改善结肠癌小鼠肠道的病理状况,缓解AOM/DSS导致的肠道损伤,并通过增加ZO-1、occludin、E-cadherin等蛋白的表达恢复肠屏障完整性。LEP130还能降低结肠癌小鼠结肠组织中的促炎因子（TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-γ）水平,抑制组织炎症。16S r RNA高通量测序结果表明,LEP130能改善结肠癌小鼠肠道菌群的结构与组成,增加肠道菌群的丰度和物种多样性。LPE130能降低（机会）致病菌和病原菌（如副杆菌属、大肠志贺氏杆菌、脱硫弧菌属、螺杆菌属、毛螺菌属-NK4A136组和厌氧支原体属等）的相对丰度,并增加短链脂肪酸产生菌和益生菌（如瘤胃梭菌属、毛螺菌属、雷沃氏菌属-NK3B31组、双歧杆菌属和罗斯氏菌属等）的相对丰度。非靶向代谢组学结果表明,LEP130能显着改善结肠癌小鼠肠道菌群的代谢状况,降低肠道中鹅去氧胆酸、脱氧胆酸和石胆酸含量,增加短链脂肪酸（乙酸、丙酸、正丁酸）和δ-生育酚含量,从而抑制结肠癌的发生。相关性分析结果表明,肠道菌群的调节与代谢物的变化具有高度的相关性。以上结果表明,LEP130能够抑制结肠癌的发生,并且这种抑制作用可能与LEP130对肠道微生物群及其代谢产物的调节相关。
于爽[6]（2020）在《NLRP3炎症小体参与食管鳞癌增殖、侵袭和迁移并介导荷瘤小鼠顺铂抵抗》文中认为研究背景我国食管癌以食管鳞状细胞癌（esophageal squamos cell carcinoma,ESCC）为最常见的病理类型。化疗抵抗引起食管鳞癌的复发和转移仍是主要临床问题。机体对化疗的反应会加强或者削弱肿瘤治疗的效果。巨噬细胞和T细胞等免疫细胞在肿瘤微环境中的浸润,也会激活机体不同的肿瘤特异的免疫反应。机体免疫缺陷可能是导致化疗抵抗的一个重要原因。因此,探究机体先天性和适应性免疫对食管鳞癌的进展和化学治疗的影响,具有重要临床意义。NLRP3炎症小体（inflammasome）是机体参与先天免疫防御过程的一种主要复合物。它是由NLRP3蛋白感受器、凋亡相关的斑点样蛋白（ASC）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶前体（procaspase-1）组成的蛋白质复合物。其功能使procaspase-1自我切割成有活性caspase-1,将促炎细胞因子pro-IL-1β和pro-IL-18裂解成有活性的白介素IL-1β和IL-18,发挥相应效应。NLRP3炎症小体在乳腺癌、肺癌、胃癌、黑色素瘤和头颈鳞状细胞癌等多种实体肿瘤异常激活发挥促癌作用。但NLRP3炎症小体在结肠癌中却阻止结肠炎恶变,起到抑癌作用。然而对食管癌仅有文献报道:脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）可激活巴雷特食管上NLRP3炎症小体,促进巴雷特食管发生癌变,但NLRP3炎症小体对食管鳞癌的具体作用尚不清楚。因此,值得进一步探究。研究也发现:某些化疗药物可激活肿瘤细胞中NLRP3炎症小体,并募集免疫细胞浸润在肿瘤微环境中,引起机体肿瘤免疫的改变影响治疗效果。CD47是一种细胞表面蛋白,是肿瘤先天免疫逃避的主要机制。CD47可与表达在巨噬细胞上的信号调节蛋白α（signal regulatory proteinα,SIRPα）相互作用,发出抗吞噬信号,阻止巨噬细胞吞噬杀伤肿瘤细胞。我们前期研究发现:人食管鳞癌组织不仅存在CD47蛋白高表达,而且大量巨噬细胞浸润,当用CD47抗体阻断CD47-SIRPα信号后,可增强巨噬细胞吞噬食管鳞癌细胞作用。因此,本研究提出科学假说:化疗药物可能激活食管鳞癌NLRP3炎症小体募集巨噬细胞到肿瘤微环境中,并可能通过CD47-SIRPα信号导致治疗抵抗。综上所述,为探索NLRP3炎症小体对食管鳞癌和治疗抵抗的作用,本课题拟从人食管鳞癌组织标本、人和小鼠食管鳞癌细胞株以及野生型C57BL/6和C57BL/6-Nlrp3-/-敲除鼠同种移植瘤动物模型三个层面开展研究。首先,明确NLRP3炎症小体在人食管鳞癌组织的表达水平以及临床意义。其次,探讨NLRP3炎症小体对食管鳞癌细胞增殖、侵袭和迁移的作用和可能机制。最后,探讨NLRP3炎症小体是否募集巨噬细胞并通过CD47-SIRPα信号引起荷瘤小鼠顺铂抵抗。本实验旨在为NLRP3炎症小体成为食管鳞癌免疫治疗新靶点提供理论依据,为研究食管鳞癌免疫微环境和治疗抵抗提供一种新的动物模型。本研究分为以下三部分:第一部分NLRP3炎症小体在人食管鳞癌组织中的表达及其临床意义方法1.收集人食管鳞癌组织和临床病理特征资料本研究收集手术切除的84例成对的原发性手术切除的食管鳞癌组织和癌旁组织为研究对象,并收集患者年龄、性别、原发肿瘤浸润深度和TNM分期、淋巴结转移和远处转移等信息。所有患者术前无放疗和化疗史。2.NLRP3炎症小体及相关蛋白的表达水平和临床意义免疫组织化学法或Western blot法检测食管鳞癌组织中NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β和Ki67的蛋白表达。ELISA法检测食管鳞癌组织和癌旁组织中IL-1β的分泌。并分析NLRP3和IL-1β蛋白表达水平与患者临床病理特征以及Ki67相关性。3.NLRP3炎症小体及相关蛋白的基因表达水平采用实时定量PCR（quantitative real-time PCR,q RT-PCR）法检测NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的m RNA表达。结果1.食管鳞癌组织中NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的蛋白表达升高与癌旁组织相比,食管鳞癌组织中NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β免疫组化染色阳性细胞数明显增加,定位在细胞质。组织化学评分（Histochemistry score,）显示,食管鳞癌组织中NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的H-score分值明显高于癌旁组织（P<0.05）。Western blot法也进一步证实:NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β蛋白表达高于癌旁组织（P<0.05）。ELISA法检测发现食管鳞癌组织中IL-1β浓度高于癌旁组织（P<0.01）。2.NLRP3和IL-1β蛋白表达与患者临床病理特征和Ki67的相关性NLRP3蛋白表达与原发肿瘤浸润深度和TNM分期有关,且差异有统计学意义（P<0.05）,而与患者的年龄、性别、淋巴结转移和远处转移无关（P>0.05）。同时也发现IL-1β蛋白表达与原发肿瘤浸润深度和淋巴结转移有关（P<0.05）。Spearman相关分析结果显示,NLRP3在食管鳞癌患者组织中异常高表达与Ki67高表达呈正相关（r=0.355,P<0.05）。3.食管鳞癌组织中NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的m RNA表达与癌旁组织比较,癌组织m RNA表达水平增加两倍以上的患者所占比例依次为:NLRP3占42.86%（18/42,P<0.01）,ASC占54.76%（23/42,P<0.01）,caspase-1占50.00%（21/42,P<0.01）和IL-1β占64.28%（27/42,P<0.01）,其表达水平存在明显个体差异性。第二部分NLRP3炎症小体对食管鳞癌细胞增殖、侵袭和迁移的作用及可能机制方法1.筛选NLRP3蛋白差异表达的食管鳞癌细胞株以人永生化食管上皮细胞Het-1A作为对照,使用Western blot法比较NLRP3在KYSE70、KYSE510、TE1、TE13、EC9706、EC1和EC109细胞株中的表达,筛选出NLRP3蛋白表达高和表达低的细胞,用于后续实验。2.改变NLPR3基因表达水平,观察其对食管鳞癌细胞生物学特性的影响通过小干扰RNA和转染过表达质粒pc DNA3.1（+）-NLRP3获得NLRP3低表达和高表达的细胞模型。然后利用CCK8法检测细胞增殖活力;通过Transwell和划痕实验检测细胞迁移能力;Transwell小室检测细胞侵袭能力。3.利用CRISPR/Cas9技术靶向敲除TE13细胞的NLPR3基因,观察其对细胞凋亡和上皮间质转化能力的影响构建CRISPR/Cas9靶向敲除NLRP3基因的TE13细胞模型（简称为TE13-Cas9/NLRP3）。通过流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western blot法检测E-钙粘蛋白（E-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）的表达,来评估上皮间质转化能力。结果1.NLRP3在不同食管鳞癌细胞的蛋白表达水平与人永生化食管上皮细胞Het-1A相比,TE13和KYSE70细胞NLRP3蛋白表达水平最高,而EC9706和KYSE510细胞表达最低,上述细胞用于后续实验研究。2.NLRP3基因表达的改变对人食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用（1）与si RNA-NC组相比,si NLRP3可使TE13和KYSE70细胞增殖能力下降、穿透基底膜进入Transwell下室细胞数明显减少,细胞迁移速度减慢,划痕愈合减慢（P<0.05）。（2）与空质粒pc DNA3.1（+）-NC相比,过表达质粒pc DNA3.1（+）-NLRP3可使EC9706和KYSE510细胞增殖能力增强、侵袭和细胞迁移速度加快,划痕愈合加快（P<0.05）。3.CRISPR/Cas9靶向敲除NLPR3基因可诱导细胞凋亡、减弱上皮间质转化能力与野生型TE13细胞相比,TE13-Cas9/NLRP3细胞凋亡率增加（P<0.05）,同时Western blot结果显示,E-钙粘蛋白表达升高,而波形蛋白下降,提示靶向敲除NLPR3基因可诱导凋亡,减弱上皮间质转化能力。第三部分NLRP3炎症小体对荷瘤小鼠顺铂抵抗的实验研究方法1.利用野生型C57BL/6小鼠以及C57BL/6-Nlrp3-/-敲除鼠,构建同种移植瘤模型和顺铂化疗模型培养制备小鼠食管鳞癌细胞（AKR细胞）悬液（1×107个/ml）,每只小鼠按0.1 ml分别接种于野生型C57BL/6小鼠和C57BL/6-Nlrp3-/-敲除鼠,建立有免疫功能的荷瘤鼠模型。当移植瘤体积达约200 mm3后,将上述荷瘤鼠随机分为模型组和顺铂组,每组入选10只。顺铂组治疗周期方案为:每只小鼠按2 mg/kg剂量给予顺铂,每天腹腔注射一次,共5天,停药2天后,再继续给药5天,建立顺铂化疗模型。模型组腹腔注射等体积生理盐水。每组均绘制移植瘤生长曲线。2.移植瘤组织细胞体外培养回种野生型C57BL/6小鼠,建立多次化疗模型无菌条件下,摘取小鼠移植瘤组织,剪碎成大小约为1 mm3组织,胰酶消化5 min、共2次,然后离心取沉淀贴壁扩大培养。同上法建立多次顺铂化疗模型。3.顺铂治疗后NLRP3表达变化对荷瘤鼠顺铂治疗效果的影响观察比较顺铂治疗后野生型和Nlrp3-/-敲除型荷瘤鼠移植瘤生长曲线的变化;比较荷瘤鼠多次顺铂治疗前后移植瘤体积的变化,并利用免疫组化及Western blot法检测移植瘤组织中NLRP3和CD47蛋白表达的变化;ELISA法检测荷瘤鼠顺铂治疗前后血清及移植瘤组织中IL-1β的含量变化。4.顺铂治疗后NLRP3表达水平的改变对巨噬细胞募集和CD47-SIRPα信号的影响利用野生型和Nlrp3-/-敲除型荷瘤鼠建立顺铂化疗模型,免疫组化法检测移植瘤内巨噬细胞标记物CD45和F4/80蛋白表达,分析比较各组H-score分值变化,评估不同NLRP3表达水平和对巨噬细胞募集的影响;Western blot法检测移植瘤组织中SIRPα和CD47蛋白的表达,探讨顺铂治疗前后NLRP3表达改变对CD47-SIRPα信号的作用。结果1.NLRP3表达对顺铂治疗效果的影响与Nlrp3-/-敲除鼠相比,野生型小鼠移植瘤生长快、体积大。顺铂对野生型小鼠抑瘤率下降（P<0.05）。提示NLRP3表达可促进移植瘤生长,降低顺铂效应。2.多次顺铂治疗野生型荷瘤鼠抑瘤率下降,出现顺铂抵抗与荷瘤模型组移植瘤体积（967.9±53.3）mm3相比,首次和二次给予顺铂治疗周期后移植瘤体积明显缩小,分别为:（423.5±10.3）mm3和（515.2±40.8）mm3（P<0.05）,而第三次给药后瘤体积为（860.23±24.2）mm3（P>0.05）,与模型组无显着性差异（P>0.05）。与模型组瘤重相比,首次和二次给予顺铂治疗周期后移植瘤重量明显减小（P<0.05）。而第三次给顺铂治疗周期后移植瘤重与模型组无显着性差异（P>0.05）。以上结果提示,随着顺铂给药周期增多,抑瘤率下降,荷瘤鼠开始出现顺铂抵抗。3.多次顺铂治疗增加荷瘤鼠移植瘤组织NLRP3蛋白表达和IL-1β含量对三次化疗模型移植瘤组织进行Western blot检测发现:与模型组相比,顺铂组移植瘤组织中NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表达增多,而且第二次和第三次顺铂周期治疗组NLRP3蛋白表达明显高于首次顺铂治疗组（P<0.05）。免疫组化H-score评分进一步证实:与荷瘤模型组相比,顺铂治疗组NLRP3蛋白随着顺铂治疗周期次数越多,蛋白表达水平越高（P<0.05）。提示:多次给予野生型荷瘤鼠顺铂可激活NLRP3炎症小体,NLRP3蛋白表达升高。ELISA结果显示:顺铂组移植瘤组织中IL-1β含量较模型组明显增高（P<0.05）,提示顺铂可能激活移植瘤组织内NLRP3分泌IL-1β所致。4.野生型荷瘤鼠在多次顺铂周期治疗后CD47蛋白表达增多,联合瘤内注射CD47抗体可逆转顺铂化疗抵抗与模型组相比,顺铂组移植瘤组织中CD47蛋白表达随着顺铂治疗次数增多,表达水平越高（P<0.05）。与单用顺铂组相比,合用CD47抗体瘤内注射,可提高顺铂抑瘤率（P<0.05）。5.NLRP3蛋白表达可促进巨噬细胞募集并高表达SIRPα与CD47作用与Nlrp3-/-敲除型荷瘤鼠相比,野生型荷瘤鼠移植瘤组织中CD45和F4/80蛋白表达升高,同时western blot检测发现组织中CD47蛋白和SIPRα蛋白表达升高（P<0.05）。与模型组相比,野生型荷瘤鼠顺铂治疗后,移植瘤组织中CD45和F4/80蛋白表达明显升高（P<0.05）,且顺铂组CD47蛋白和SIPRα蛋白表达也较模型组显着升高（P<0.05）。但Nlrp3-/-敲除型荷瘤鼠在顺铂治疗前后无明显统计学差异（P>0.05）。以上结果提示:顺铂可促进巨噬细胞浸润,并增强CD47-SIRPα信号抑制巨噬细胞吞噬作用。结论1.人食管鳞癌组织中NLRP3高表达,与患者TNM分期和淋巴结转移有关。下调食管鳞癌NLRP3蛋白表达可抑制细胞增殖、迁移和侵袭能力,其机制可能与NLRP3低表达诱导凋亡,减弱上皮间质转化有关。2.顺铂治疗可使野生型C57BL/6小鼠移植瘤组织中NLRP3和CD47蛋白表达上升,抑瘤率下降,引起治疗抵抗。顺铂联合瘤内注射CD47抗体可逆转治疗抵抗。其机制可能与NLRP3募集巨噬细胞浸润,增强SIRPα-CD47信号有关。
李晓飞[7]（2020）在《结直肠癌患者肠道菌群促进Apcmin/+小鼠腺瘤癌变的研究》文中研究表明目的:人体与微生物处于共生状态。在致病因素作用下,肠道微生物就会出现平衡失调,造成菌群紊乱,致病菌增加,有益菌减少,从而诱发肠道炎症,进而促进肿瘤生长。目前相关研究多集中在肠道肿瘤患者肠道菌群的检测及相关性分析,肠道菌群失衡在腺瘤进展转化过程中的作用机制如何?哪些关键因素参与这一过程?其关键信号通路是什么?本课题的研究目的将着重探讨这些问题。方法:天津医科大学总医院内镜中心及消化内科就诊且病理检查确诊为结直肠癌的患者,筛选符合条件的10名患者,留取粪便制备菌液。同时筛选出10名符合条件的健康者进行新鲜粪便收集,将收集到的新鲜粪便放入粪便盒中,做好标记,-80℃冰箱中保存。实验动物选择4周龄SPF级野生型C57BL/6J小鼠,4周龄SPF级雌性Apcmin/+小鼠。分为4组:FMT-CH组（C57BL/6J小鼠移植健康者粪菌液）、FMT-CC（C57BL/6J小鼠植入肠癌患者粪菌液）、FMT-AH(Apcmin/+小鼠植入健康者粪菌液)和FMT-AC(Apcmin/+小鼠植入肠癌患者粪菌液)。为了使菌群在肠道更易定植,实验前3天各组小鼠分别给予服用含有0.2g/L氨苄青霉素+0.2g/L新霉素+0.2g/L甲硝唑+0.1g/L万古霉素的饮用水。粪菌移植（FMT）第1周,每天灌胃1次,共7次;FMT第2周,隔天灌胃1次,共3次;FMT第3周开始,每周1次,共6次;整个实验过程中,FMT共计进行16次。整个FMT过程中,每天需观察小鼠的基本情况,包括活动状态、进食水量及鼠笼中血迹情况,每周称量体重1次。于实验开始前及实验结束后（实验第9周）,收集小鼠新鲜粪便,进行肠道菌群16S r RNA焦磷酸测序。运用q PCR方法检测肠道组织各种炎症细胞因子及结肠粘膜屏障相关因子水平（包括ZO-1、Claudin3、Occludin、Muc2、Cryptdin、NLRP3、IL-1β及TNF-α等）。免疫组织化学Ki-67染色。运用Western blot方法检测总β-catenin、cyclin D1、c-myc、β-actin表达量。分离结肠粘膜组织总RNA,用分光光度计测定RNA质量,并用互补DNA（c DNA）转换试剂盒进行反向转录。实时荧光定量PCR检测Apcmin/+小鼠结肠组织基因表达量。计算样本质检表达量的差异倍数（Fold change）,筛选出>2或<0.5的差异表达基因,探讨差异表达基因对腺瘤癌变的机制及临床预后分析。结果第一部分（1）结直肠癌粪菌液供体选取符合入组标准。结直肠癌及健康者粪菌液供体间平均年龄无明显差异。两者的BMI亦无明显差异。（2）与健康者的粪便混合上清液相比,CRC患者粪便混合上清液中Roseburia的相对丰度在属水平上降低。而CRC患者粪便混合上清液中Akkermansia的相对丰度较健康者增加。第二部分（1）实验周期8周结束后,FMT-CC组和FMT-CH组小鼠全肠道均未出现腺瘤。FMT-AH组小鼠肠道出现多发散在腺瘤,以小肠近端和中段明显;FMT-AC组全肠道腺瘤明显增多,部分结肠近端可见明显增大的腺瘤。病理结果显示,FMT-AH组30%的肠道腺瘤中可见高级别上皮内瘤变,FMT-AC组90%的小鼠肠道腺瘤可见高级别上皮内瘤变,部分腺瘤病理提示黏膜内癌。（2）FMT-AC组小鼠肠道肿瘤Ki-67阳性细胞百分比较FMT-AH组明显升高,差异有统计学意义。Western blot技术检测小肠肿瘤组织中总β-连环蛋白、cyclin D1和c-myc的蛋白水平,FMT-AC组较FMT-AH组均明显增加。（3）FMT-AC组小鼠ZO-1、Claudin3、OClaudin、Muc2和Cryptdin的m RNA相对表达量明显低于FMT-AH组。（4）FMT-AC组小鼠较FMT-AH组小鼠表现为更为明显的肠道低度炎症,实时荧光定量PCR显示FMT-AC组小鼠肠道上皮细胞IL-1β、NLRP3及TNF-α相对表达量较FMT-AH组明显升高。（5）FMT-AC组小鼠回盲部短链脂肪酸（包括乙酸、丙酸、丁酸）的水平明显低于FMT-AH组。（6）FMT移植结束后,FMT-AH组和FMT-AC组粪便行16S r RNA测序分析,在属水平上,分析结果显示FMT-AC组肠道菌群构成中致病菌Prevotella较FMT-AH组显着增多,差异具有统计学意义。而益生菌属Parasutterella较FMT-AH组减少,但并无统计学差异。第三部分（1）RNA-seq高通量测序筛选出FMT-AC与FMT-AH之间差异表达基因,得到了278个符合要求的差异基因,其中228个上调基因,50个下调基因。（2）对所得到的差异基因（DEG）进行功能注释。GO分析结果得出,Wnt蛋白结合、脂质代谢过程和免疫应答途径明显增强。（3）KEGG分析显示,在注释到KEGG的差异基因主要分布在T细胞受体信号通路、RAS信号通路、Wnt信号通路和NF-κB信号通路。（4）Hubba基因应用Cytoscape工具进行差异表达基因的网络互作分析,筛选感兴趣的Hubba基因Esr1。应用TCGA数据库,在结肠癌和癌旁组织中均存在差异表达,进一步行生存分析及免疫浸润分析。（5）生存分析在总体生存率方面,ESR1的不同表达水平直接影响到机体的生存时间,与患者的总生存期存在着显着的关系。（6）免疫浸润分析应用TIMER和TISIDB在线分析工具,ESR1表达与免疫浸润淋巴细胞和免疫调节剂之间存在显着相关。结论:1、结直肠癌患者肠道菌群整体上可以促进结直肠腺瘤癌变。2、肠道菌群紊乱可能通过促进炎症反应、降低短链脂肪酸浓度和激活Wnt信号通路促进腺瘤癌变。3、RNA-seq结果显示Wnt蛋白结合、脂质代谢过程和免疫应答途径明显增强可能与腺瘤癌变密切相关。4、差异表达基因Esr1在结肠腺瘤癌变过程中参与免疫逃逸,促进肿瘤的发展。
顾凯娟[8]（2019）在《薏苡附子败酱对肠道腺瘤的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理目的:大肠腺瘤是肠道良性的上皮肿瘤,也是大肠癌重要的癌前病变,超过90%的肠癌是由肠道腺瘤发展而来。中医药在防治大肠癌癌前病变方面具有良好的临床疗效。因此,本课题以肠道腺瘤为研究对象,采用《金匮要略》中治疗肠痈为主的薏苡附子败酱散进行干预,观察其对大肠腺瘤的发生、生长的影响,以及对APC基因突变自发形成肠道腺瘤小鼠的免疫调节作用;探讨其在T淋巴细胞调节大肠腺瘤的发生发展中的作用机制,为临床运用薏苡附子败酱散防治结大肠癌提供实验依据。方法:（1）将C57BL/6J雌性小鼠与APCMin/+雄性小鼠合笼繁殖,通过PCR核酸电泳实验进行基因型鉴定,从子代小鼠中挑选出APCMin/+小鼠用于后续实验。（2）将实验小鼠随机分组,连续灌胃20周,每周称量小鼠体重。20周后取小鼠外周血、脾、肠道和肠系膜组织,计数肠道腺瘤的数目,进行统计分析。（3）通过HE染色鉴定肠道腺瘤的癌变程度;通过免疫组化法检测肠道肿瘤组织中Ki67、PCNA的表达,用Brd U标记肠腺瘤增殖细胞。（4）通过荧光定量PCR技术分析APCMin/+小鼠肠道腺瘤中T淋巴细胞相关基因转录水平。（5）采用ELISA方法对APCMin/+小鼠外周血中免疫相关的细胞因子进行检测;采用流式细胞仪对小鼠脾、肠系膜、小肠固有层淋巴细胞中辅助性T淋巴细胞进行分选与分析。（6）采用CCK-8法检测薏苡附子败酱散对HCT116、MC-38细胞增殖的影响,以及使用台盼蓝试验检测薏苡附子败酱散对小鼠脾、外周血中淋巴细胞的影响。（7）通过台盼蓝实验、克隆形成实验和Western-blot实验检测薏苡附子败酱散和APCMin/+小鼠脾Treg细胞上清对MC-38细胞生长及相关蛋白表达的影响。结果:（1）与模型组小鼠比较,薏苡附子败酱散灌胃给药20周后,小肠腺瘤数、大肠腺瘤数均显着减少（P<0.01）。病理结果显示,模型组小鼠的大肠部位出现原位癌,小肠部位出现典型的腺癌伴局部黏膜下侵犯;薏苡附子败酱散组小鼠大肠未见原位癌,小肠则为高级别腺瘤多见,提示薏苡附子败酱散有效降低肠道腺瘤的恶变程度。IHC结果显示,与模型组比较,Ki67和PCNA蛋白阳性表达率明显降低（P<0.01）。（2）APCMin/+小鼠肠道腺瘤组织的荧光定量PCR结果显示,与模型组比较,治疗组的T-bet、ROR-γ的m RNA表达量升高,而Gata3、Foxp3的m RNA表达量下降（P<0.01）。APCMin/+小鼠脾、肠系膜淋巴细胞和小肠固有层淋巴细胞流式分析结果显示:与模型组比较,治疗组的Treg细胞明显减少;小鼠血清中的IL-10、IL-6的含量显着降低,IL-17A和TNF-α的含量明显升高（P<0.01）,且随着薏苡附子败酱散浓度的增加而呈现剂量依赖效应。提示薏苡附子败酱散可增强了Th1、Th17的细胞功能,而抑制了Th2、Treg的细胞功能。（3）体外CCK-8实验结果显示,薏苡附子败酱散对HCT116细胞和MC-38细胞生长无明显的抑制作用,差异无统计学意义（P>0.05）;台盼蓝实验检测薏苡附子败酱散对小鼠外周血和脾淋巴细胞的增殖无抑制作用。（4）台盼蓝活细胞计数实验和克隆形成实验显示,薏苡附子败酱散干预Treg细胞后的上清能够抑制MC-38细胞的增殖;Western-blot实验结果显示,与对照组相比,药物干预组的Ki67、PCNA蛋白表达下降,差异有统计学意义（P<0.01）。结论:（1）薏苡附子败酱散可改善了APCMin/+小鼠的生存质量,减少肠道腺瘤的数目。（2）薏苡附子败酱散能够降低APCMin/+小鼠肠道组织的Ki67和PCNA蛋白阳性表达率,并降低肠道腺瘤细胞的分化级别。（3）薏苡附子败酱散能够改变APCMin/+小鼠脾、肠系膜、肠道淋巴细胞相关因子的表达,增强Th1、Th17的细胞功能,抑制Th2、Treg的细胞功能。降低治疗组小鼠脾、肠系膜、小肠固有层淋巴细胞中辅助性T淋巴细胞的比例。下调IL-6、IL-10等促瘤细胞因子的表达,升高TNF-α、IL-17A等抑瘤细胞因子的表达。（4）薏苡附子败酱散可通过调节Treg细胞抑制MC-38细胞的生长及相关蛋白Ki67、PCNA的表达。
吴迪[9]（2019）在《卵巢癌干细胞疫苗抗卵巢癌疗效及机制研究》文中指出卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,其中上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer,EOC）占85%-90%。尽管化疗方案不断优化,但是EOC治疗效果却不尽人意,5年生存率仍徘徊于30%-40%,复发率超过60%,死亡率居妇科恶性肿瘤首位。EOC已成为严重威胁女性生命和健康的恶性肿瘤。癌干细胞（cancer stem cell,CSC）是肿瘤组织中一小部分具有自我更新、分化、无限增殖等干细胞特性的肿瘤细胞,是肿瘤发生发展的根源,与肿瘤的化疗耐药、转移侵袭以及复发密切相关。所以,探究EOC CSC的特性,寻找针对靶向CSC治疗EOC有效方法,是控制并根治卵巢癌的关键。近年来肿瘤免疫治疗受到高度关注,在基础研究和临床应用研究方面都取得了一些可喜的进展,而针对靶向CSC的免疫治疗目前主要倾向于:靶向CSC表型的免疫治疗、靶向CSC的T细胞过继免疫、靶向CSC的DC疫苗、靶向CSC憩室的免疫治疗、免疫检查点、CSC疫苗等,特别是疫苗研究,因其能激活机体的自然杀伤细胞（NK）和特异性细胞毒性T细胞（CTL）、产生抗肿瘤的保护性抗体等免疫应答,是一种有应用前景的肿瘤免疫治疗方法。然而,由于肿瘤抗原免疫原性较弱、肿瘤的异质性、肿瘤免疫逃逸机制的复杂性等原因,尽管有众多的可喜研究报道,但肿瘤疫苗的实际疗效与预期效果仍有很大的差距,要作为治疗性肿瘤疫苗用于临床,仍有一些障碍需要克服,关键是如何提高肿瘤疫苗免疫原性,激发宿主免疫反应对瘤细胞免疫攻击。最新研究显示,CSC疫苗因其高表达优势抗原,可引发有效的靶向CSC免疫反应,达到抑制肿瘤生长和转移的效应,更引人关注。本课题组前期研究已发现,CD44+CD117+的EOC SKOV3/HO8910细胞具有CSC特性。因此,本研究将EOC CSC分离出来,采用简捷的工艺方法直接制备溶解完整的CSC疫苗,探究该疫苗抗卵巢癌效应及其机制。目的:探究EOC CSC疫苗在动物体内诱发抗肿瘤效应及其可能机制,为今后临床上使用该疫苗防治卵巢癌提供实验和理论依据。方法:1.通过免疫磁珠分选系统（MACS）从人EOC SKOV3/HO8910两种细胞系中分离出CD117+CD44+CSC,经反复冻融三次将其制备成CSC疫苗再接种到免疫缺陷的裸鼠体内（4×105CD117+CD44+CSC/鼠）,总共三次,每两次免疫间隔10天,末次免疫后第10天,再用5×106个野生型SKOV3/HO8910细胞皮下攻击免疫小鼠。通过观察体内肿瘤生长及各免疫小鼠生存情况,初步评价SKOV3和HO8910 CSC疫苗的抗癌效果。通过流式细胞仪（FCM）分析免疫鼠肿瘤细胞的CD117+CD44+亚群以及I型乙醛脱氢酶高表达(ALDH-1high)细胞群比例;此外,酶联免疫吸附实验（ELISA）检测小鼠外周血清IFN-γ和TGF-β细胞因子水平,细胞杀伤实验测定NK细胞杀伤能力,实时定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）和免疫印迹实验（Western blotting）检测小鼠肿瘤组织中颗粒酶和穿孔素以及NKG2D和MICA的表达水平,初步分析抗瘤效应及其分子机制。同时,经NOD/SCID鼠模型反向验证CSC疫苗的免疫效应。2.因受体酪氨酸激酶孤儿样受体1（ROR1）分子可能是EOC CSC的一种优势抗原,在CSC疫苗激发机体免疫反应中具有重要作用。本研究分别设计针对ROR1基因序列短发夹RNA（shROR1）以及采用Gateway位点专一性重组方法,扩增ROR1序列,分别构建下调或上调ROR1的慢病毒重组质粒（pLV-shROR1或pLV-ovROR1）,进行慢病毒包装,利用倍比稀释法测定病毒滴度,再将含有pLV-shROR1和pLV-ovROR1慢病毒感染细胞,筛选出稳定表达ROR1的细胞克隆并扩大培养。用MACS分离出HO8910-pLV-shROR1 CD117+CD44+CSC（简称HO8910-shROR1 CSC）和HO8910-pLV-ovROR1CD117+CD44+CSC（HO8910-ovROR1 CSC）,用上述同样方法制备成疫苗后接种到免疫缺陷的裸鼠体内,再用5×106个野生型HO8910细胞皮下攻击免疫小鼠。经体内致瘤实验分别评价下调或上调ROR1的HO8910 CSC疫苗的抗癌效果;FCM、ELISA、NK杀伤实验、qRT-PCR、Western blotting等实验进一步分析优势抗原ROR1对HO8910 CSC疫苗抗瘤效应的影响。3.用无血清培养法（SFM）,筛选出鼠源性EOC细胞株ID8卵巢癌干样细胞（OCSC）,取2×105OCSC经反复冻融三次将其制备成疫苗,接种到C57BL/6小鼠体内,总共三次,每两次免疫间隔10天,末次免疫后第10天,再用2×106个野生型ID8细胞皮下攻击免疫小鼠,观察免疫小鼠生存和肿瘤生长情况。继而构建下调ROR1的重组质粒,进行慢病毒包装并使用倍比稀释法测定病毒滴度,将含有pLV-shROR1的慢病毒感染小鼠卵巢癌ID8细胞,用qRT-PCR和Western bloting分析ID8细胞中ROR1分子下调表达情况。再用上述同样方法,在C57BL/6小鼠体内评价ID8-OCSC和ID8-OCSC-shROR1疫苗抗癌效果。采用FCM、ELISA、NK杀伤实验、CD4+T和CD8+T细胞杀伤实验、补体依赖的细胞毒活性（CDC）,qRT-PCR和Western blotting进一步分析疫苗诱发的免疫反应以及抗瘤效应与机制。此外,本研究还进行了用树突状细胞（DC）负载OCSC裂解物用于疫苗实验,试图比较两种方法制备的疫苗在诱导免疫鼠抗EOC效应是否有明显差异。结果:1.疫苗免疫鼠肿瘤体积大小、瘤体生长曲线及小鼠无瘤生存期显示,SKOV3/HO8910 CD117+CD44+CSC疫苗能在无胸腺裸鼠体内中诱导免疫反应,体现在接种CD117+CD44+CSC疫苗的小鼠,与non-CD117+CD44+CSC疫苗组和SKOV3/HO8910细胞疫苗组及PBS组相比,肿瘤形成时间延迟、肿瘤体积较小、荷瘤鼠生存时间延长;血清中IFN-γ水平升高,TGF-β水平降低,且具有较强的NK杀伤活性。这些结果与不同对照组相比,差异有显着性意义（p（27）0.05）。另外,qRT-PCR结果显示,SKOV3/HO8910 CD117+CD44+CSC疫苗免疫的小鼠肿瘤组织中,具有更高水平的穿孔素和颗粒酶表达;同时,qRT-PCR和Western blotting结果显示,肿瘤组织中具有高水平的NKG2D和MIC A表达（p（27）0.05）。此外,SKOV3/HO8910 CD117+CD44+CSC疫苗能够显着地减少小鼠卵巢癌异体移植瘤组织中CD117+CD44+CSC细胞群以及ALDH-1high细胞群比例。结果提示:SKOV3/HO8910CSC疫苗能靶向杀伤EOC CSC,抑制裸鼠体内肿瘤生长;而在NOD/SCID鼠模型因其T和B淋巴细胞严重缺乏,却没有明显抑瘤效应,从而反向证明了CSC疫苗的抗瘤效应是因其诱发免疫效应所致。2.分别筛选出感染pLV-shROR1的HO8910-pLV-shROR1细胞（简称HO8910-shROR1）和过表达ROR1分子的HO8910-pLV-ROR1细胞（简称HO8910-ovROR1）。qRT-PCR和Western blotting分析显示,ROR1分子分别被有效地下调和上调,表明从基因和蛋白水平证实,在HO8910细胞调控ROR1表达成功。HO8910-shROR1或HO8910-ovROR1细胞扩大培养后,经MACS分选出CD117+CD44+CSC,制备疫苗免疫裸鼠结果显示,HO8910-shROR1和HO8910-ovROR1以及HO8910三组CD117+CD44+CSC疫苗,在免疫鼠激发的抗HO8910卵巢癌效应中,HO8910-ovROR1 CSC疫苗抗瘤效果最强,小鼠肿瘤生长最慢,体积最小,无瘤生存期最长,HO8910 CSC疫苗次之（p（27）0.05）,HO8910-shROR1疫苗最低（p（27）0.05）。ROR1高表达的HO8910-ovROR1 CSC疫苗免疫鼠,在三组疫苗免疫鼠中,血清IFN-γ和抗ROR1水平最高,而TGF-β水平最低;同时,NK杀伤能力也最强。qRT-PCR结果显示HO8910-ovROR1 CSC疫苗组,小鼠肿瘤组织中含有较高水平的颗粒酶和穿孔素,qRT-PCR和Western blotting显示,表达高水平NKG2D和MIC A（p（27）0.05）。此外,以HO8910-ovROR1 CSC为基础的疫苗能够更明显地下调裸鼠卵巢癌异体移植瘤组织中CD117+CD44+CSC亚群以及ALDHhigh细胞群的比例。以上结果证实:ROR1分子可能是EOC CSC疫苗的优势抗原,在HO8910 CSC疫苗中发挥关键的免疫原性作用。3.ID8-OCSC疫苗在C57BL/6小鼠体内抗肿瘤实验结果显示,从肿瘤生长速度、肿瘤大小以及无瘤生存期显示方面,明显优于非ID8-OCSC疫苗组,差异有统计学意义（p<0.05）。将ROR1分子下调后,ID8-OCSC-shROR1疫苗组小鼠的抗肿瘤效应显着弱于ID8-OCSC疫苗组（p<0.05）,且NK细胞和脾细胞杀伤能力、抗体水平、CDC活性、血清IFN-γ水平等均显着下降（p<0.05）,但TGF-β水平则升高（p（27）0.05）。对ID8-OCSC疫苗激发免疫鼠脾脏T细胞功能检测显示,分离的CD4+T和CD8+T细胞对靶细胞杀伤实验与与ID8-OCSC-shROR1疫苗相相比,ID8-OCSC疫苗免疫鼠的CD4+T和CD8+T杀伤能力最强,特别是CD8+T的杀伤能力更为明显。qRT-PCR分析显示,ID8-OCSC疫苗组瘤组织中颗粒酶和穿孔素分子表达高于ID8-OCSC-shROR1和ID8疫苗组;同时,NKG2D和MIC A的水平也高于其他对照组,差异有显着性意义（p（27）0.05）。此外,FCM分析肿瘤组织中ALDHhigh细胞群比例明显减少,而ID8-OCSC-shROR1和ID8疫苗组依次增高,提示ID8-OCSC疫苗能诱导免疫鼠靶向杀伤OCSC。该结果不仅说明ID8 OCSC疫苗有较强的抗肿瘤免疫效应,而且进一步证实ROR1分子可能是ID8 OCSC疫苗的优势抗原,当其下调后,在C57BL/6小鼠诱发抗肿瘤免疫效应也随之减弱。此外,反复冻融OCSC制备的疫苗与反复冻融OCSC负载DC制备的疫苗诱导小鼠的抗EOC效应相似,虽略有差异,但无统计学意义。结论:1.人源性EOC SKOV3/HO8910 CD117+CD44+CSC疫苗能诱导免疫鼠产生抗肿瘤效应,拮抗卵巢癌生长,其效应机制与其高表达ROR1优势抗原诱导强免疫反应相关,下调或上调ROR1分子表达,可影响CSC疫苗的免疫效应和抗卵巢癌效应。2.鼠源性ID8 OCSC疫苗能诱发C57BL/6免疫鼠产生免疫效应而抑制卵巢癌生长,其效应机制与其高表达ROR1优势抗原相关,下调ROR1分子表达,可影响ID8 OCSC疫苗的免疫效应和抗卵巢癌效应。3.本研究制备的EOC CSC疫苗有效地增强免疫鼠产生抗肿瘤效应,这为临床上应用CSC疫苗免疫防治EOC提供了科学的实验依据。
周李宁[10]（2019）在《LincRNA-p21调控TAMs的功能参与抗肿瘤免疫应答的研究》文中研究表明目的:在实体瘤中,肿瘤微环境分泌的细胞因子可募集血液循环中的单核细胞到达肿瘤部位,诱导其激活分化为肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages,TAMs）在早期发挥抗肿瘤作用,而到肿瘤的后期则发挥着促进肿瘤发展作用。由于巨噬细胞的可塑性,长链非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA）可潜在调控巨噬细胞表型改变,进而促进其发挥抗瘤作用而抑制其免疫抑制作用。本论文初步探讨lincRNA-p21对肿瘤相关巨噬细胞表型转换的调控,并研究其潜在的调节机制,为临床肿瘤的诊疗提供新的靶点。方法:（1）选取自发乳腺癌小鼠的乳腺组织,采用免疫组化的方法检测巨噬细胞在乳腺肿瘤组织中的浸润情况。收集正常培养的RAW264.7和4T1肿瘤上清刺激过的RAW264.7进行lncRNA表达芯片的检测及后续的高级分析（委托上海欧易医学生物科技有限公司）,筛选差异明显的lncRNA采用荧光实时定量PCR（real time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR）进行验证,选取表达量高、表达稳定的lncRNA作为研究对象。此外,收集小鼠肿瘤细胞CT26和Lewis的培养上清刺激巨噬细胞RT-qPCR检测lincRNA-p21的表达情况。设计小鼠lincRNA-p21特异性小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）（si-lincRNA-p21）,并用RT-qPCR和带荧光标记的si-lincRNA-p21验证其干扰效果及干扰效率。（2）确定lincRNA-p21的抑制对4T1肿瘤上清刺激的巨噬细胞自身的影响,采用CCK-8试剂盒检测巨噬细胞增殖情况;利用Annexin-V/PI试剂盒检测巨噬细胞凋亡情况;采用酶联免疫吸附技术（ELISA）检测巨噬细胞分泌IL-4、IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α的情况;利用流式细胞术（FCM）检测巨噬细胞表面标记CD80、CD86、CD206及MHCⅡ的表达情况;利用Western-blot测定巨噬细胞中精氨酸酶-1（Arg-1）、一氧化氮合酶（iNOS）的表达;利用大肠杆菌标准菌株检测巨噬细胞的吞噬功能。（3）研究低表达lincRNA-p21的巨噬细胞与4T1肿瘤细胞共培养后对肿瘤细胞的影响,si-lincRNA-p21转染巨噬细胞后与肿瘤细胞共培养,采用CCK-8试剂盒检测肿瘤细胞增殖情况;利用Annexin-V/PI试剂盒检测肿瘤细胞凋亡情况;利用Transwell小室检测肿瘤细胞的迁移能力;利用划痕实验检测肿瘤细胞的迁移能力;FCM检测巨噬细胞表面FasL的表达及肿瘤细胞表面Fas的表达。（4）采用小鼠脾脏单核细胞分离试剂盒分离正常小鼠脾脏单核细胞,流式细胞分选仪分选荷瘤小鼠肿瘤组织中浸润的巨噬细胞,RT-qPCR检测原代细胞中lincRNA-p21的表达情况。用1×106个si-lincRNA-p21转染巨噬细胞混合等量的4T1肿瘤细胞皮下注射BALB/c小鼠,每7天在同一位置注射1×106个si-lincRNA-p21转染的巨噬细胞,连续监测小鼠皮下瘤生长情况和小鼠生存情况,实验结束处死小鼠后称量小鼠肿瘤质量。为了探讨lincRNA-p21调控巨噬细胞发生表型转换的潜在机制,利用Western-blot测定lincRNA-p21调控的下游基因Bax和Bcl-2及与lincRNA-p21相互作用的蛋白p53和MDM2的表达情况;采用FISH探针检测lincRNA-p21在巨噬细胞中的定位及与p53和MDM2相互结合的情况;Western-blot测定4T1肿瘤上清刺激敲低lincRNA-p21的巨噬细胞后STAT3和p65的磷酸化水平的表达。结果:（1）与正常巨噬细胞RAW264.7相比,4T1肿瘤上清刺激后RAW264.7中lincRNA-p21表达上调（p<0.05）;CT26和Lewis肿瘤上清刺激RAW264.7后lincRNA-p21表达也上调（p<0.05）。（2）与NC组相比,CCK-8检测敲低lincRNA-p21的巨噬细胞增殖增加（p<0.05）,凋亡减少;ELISA检测敲低lincRNA-p21的巨噬细胞分泌促炎因子IL-6、IL-12和TNF-α增多（p<0.05）,抑炎因子IL-4减少（p<0.05）;同时FCM结果显示与对照组相比,敲低lincRNA-p21的巨噬细胞表达CD206的比例降低,表达CD86的比例增加,而对巨噬细胞表达CD80和MHCⅡ没有显着影响。并且与NC组相比,lincRNA-p21敲低组巨噬细胞表达Arg-1减少,表达iNOS增多。同时lincRNA-p21的抑制对巨噬细胞吞噬功能也没有影响。（3）将巨噬细胞与4T1肿瘤细胞共培养后,CCK-8检测与敲减lincRNA-p21的巨噬细胞共培养后4T1肿瘤细胞增殖减缓（p<0.05）,凋亡增多;与NC组相比,4T1肿瘤细胞与敲减lincRNA-p21的巨噬细胞共培养后迁移能力减弱（p<0.05）。同时FCM结果显示,巨噬细胞表面FasL和4T1肿瘤细胞表面Fas的表达并无明显改变。（4）分离原代单核细胞和肿瘤相关巨噬细胞,RT-qPCR检测lincRNA-p21的表达发现与细胞系结果一致,肿瘤组织中lincRNA-p21表达上调（p<0.05）。与对照组相比,注射转染si-lincRNA-p21巨噬细胞的小鼠肿瘤生长速度减缓（p<0.05）,肿瘤质量减少（p<0.05）,小鼠生存时间延长（p<0.05）。Western-blot结果显示,敲减lincRNA-p21可促进巨噬细胞Bcl-2的表达,抑制Bax的表达,同时对p53及MDM2无明显影响,并且4T1肿瘤上清刺激敲减lincRNA-p21的巨噬细胞24h时,STAT3和p65的磷酸化水平显着上调。FISH探针的结果显示,lincRNA-p21在巨噬细胞中主要定位于细胞胞浆内,且4T1肿瘤上清刺激后,lincRNA-p21与p53的结合显着增强,而与MDM2的结合较弱。结论:肿瘤相关巨噬细胞中lincRNA-p21表达上调,抑制lincRNA-p21的表达可促进巨噬细胞发挥抗肿瘤免疫。
二、E.coli DNA抗肿瘤免疫的动态实验研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、E.coli DNA抗肿瘤免疫的动态实验研究（论文提纲范文）
（1）肺癌源性吲哚胺2,3-双加氧酶1在T细胞耗竭中的作用及其抗癌免疫治疗的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 肺癌与免疫逃逸 |
| 1.2 吲哚胺2,3–双加氧酶 |
| 1.3 T细胞耗竭 |
| 1.4 T细胞表面抑制性受体 |
| 1.4.1 程序性细胞死亡受体1 |
| 1.4.2 B和T淋巴细胞衰减因子 |
| 1.4.3 细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4 |
| 1.5 免疫调节细胞因子 |
| 第二章 肺癌源性IDO1 在耗竭性T细胞中的作用的体外实验研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 细胞株及动物来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要的试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 siRNA的转染 |
| 2.2.3 q PCR检测siRNA转染后LLC细胞IDO1 m RNA的表达 |
| 2.2.4 Western-blot检测siRNA转染后LLC细胞IDO1 蛋白的表达 |
| 2.2.5 不同处理的LLC细胞与T细胞共培养 |
| 2.2.6 肺癌细胞中IDO1 沉默对T细胞的增殖与凋亡情况:CFSE法检测增殖,Annexin-V/PI检测凋亡 |
| 2.2.7 流式细胞术检测耗竭性T细胞的抑制性受体:PD1、BTLA |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 体外IDO1-siRNA降低LLC细胞中的IDO1 的表达 |
| 2.3.2 LLC细胞中IDO1 降低对T细胞增殖能力和凋亡能力的影响 |
| 2.3.3 LLC细胞中的IDO1 基因沉默对CD8~+T细胞的抑制性受体PD-1和BTLA的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 肺癌中IDO1 低表达抑制T细胞耗竭及肿瘤生长的体内实验研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞及动物来源 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要的试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 建立荷瘤小鼠模型 |
| 3.2.2 质粒提取 |
| 3.2.3 治疗荷瘤小鼠 |
| 3.2.4 肿瘤生长监测 |
| 3.2.5 制作石蜡病理切片 |
| 3.2.6 免疫组织化学染色 |
| 3.2.7 免疫组织化学染色结果评估 |
| 3.2.8 各治疗组耗竭性T细胞的抑制性受体:PD1、BTLA的表达 |
| 3.2.9 ELISA法检测细胞因子:TNF-α、IL-2 |
| 3.2.10 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 IDO1-sh RNA对肺癌荷瘤小鼠的治疗效果 |
| 3.3.2 肺癌荷瘤小鼠能增加CD4~+、CD8~+T 细胞PD-1、BTLA的表达 |
| 3.3.3 体内IDO1-sh RNA沉默IDO1 表达抑制了CD4~+、CD8~+T 细胞PD-1、BTLA的表达 |
| 3.3.4 体内IDO1-sh RNA沉默IDO1 表达恢复了细胞因子的分泌 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间研究成果 |
| 综述 IDO1与T细胞耗竭在肿瘤中的作用 |
| 参考文献 |
（2）第一部分：基于胆汁DNA中突变和甲基化的平行分析建立胆胰系统恶性肿瘤辅助诊断模型 第二部分：肠道微生物中有益菌群与晚期胸部肿瘤患者接受抗PD-1免疫治疗疗效相关性的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 第一部分 基于胆汁DNA中突变和甲基化的平行分析建立胆胰系统恶性肿瘤辅助诊断模型 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 临床样本 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 主要仪器 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 引物合成 |
| 2.4 Bilescreen靶向测序区域的选择和引物设计 |
| 2.5 Exkubit工作溶液的配制 |
| 2.6 活检组织基因组DNA提取 |
| 2.7 胆管细胞刷中脱落细胞基因组DNA提取 |
| 2.8 胆汁的分装和保存 |
| 2.9 胆汁沉淀基因组DNA提取 |
| 2.10 胆汁上清液中游离DNA提取 |
| 2.11 胆汁DNA中人源DNA质量评价 |
| 2.12 胆汁DNA中细菌来源DNA的质量评价 |
| 2.13 超声打断胆汁基因组DNA |
| 2.14 胆汁样本MC文库构建 |
| 2.15 测序数据的生物信息分析流程 |
| 2.16 胆汁16S rDNA V4扩增子测序 |
| 2.17 胆汁16S rDNA V4扩增子上机测序 |
| 2.18 胆汁16S rDNA V4扩增子数据分析 |
| 实验结果 |
| 1. 患者临床资料 |
| 2. 胆汁中DNA片段大小分布 |
| 3. 胆汁样本中细菌DNA和人源DNA质量评估 |
| 4. 胆汁DNA测序质控结果 |
| 5. 胆汁DNA与配对的活检组织/细胞刷样本的突变一致性分析 |
| 6. 胆胰系统恶性肿瘤辅助诊断模型(Bilescreen)的建立 |
| 6.1 训练数据集(Training set)模型的建立 |
| 6.2 验证数据集( Validation set)对Bilescreen模型的优化 |
| 6.3 以测试数据集(test set)评估Bilescreen模型泛化能力 |
| 6.4 Bilescreen的检测结果与血清CA19-9的检测结果比较分析 |
| 7. 胆汁中细菌16S rDNA V4扩增子测序结果分析 |
| 7.1 利用荧光定量PCR方法初步评估胆汁DNA中细菌DNA含量 |
| 7.2 胆汁中细菌16S rDNA V4扩增子文库构建 |
| 7.3 胆汁中微生物多样性的初步分析 |
| 7.4 良性组患者和恶性组患者的胆汁中微生物菌群差异分析 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 肠道微生物中有益菌群与晚期胸部肿瘤患者接受抗PD-1免疫治疗疗效相关性的研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 临床样本 |
| 1.2 主要耗材及试剂 |
| 2. 实验步骤 |
| 2.1 粪便样本采集 |
| 2.2 粪便样本中微生物DNA提取 |
| 2.3 粪便样本16S rDNA V4扩增子建库 |
| 2.4 粪便样本PCR2纯化产物质量评价 |
| 2.5 上机测序 |
| 2.6 肠道16S rDNA V4扩增子文库的生物信息学分析 |
| 2.7 统计方法 |
| 实验结果 |
| 1 临床资料 |
| 2 有效组和无效组患者基线便样品中肠道菌群多样性的比较分析 |
| 3 有效组和无效组患者基线便样本微生物组成成分分析 |
| 4 基线便样本中肠道共生菌混合物与免疫治疗疗效的关系 |
| 5 肠道菌群在抗PD-1免疫治疗过程中的变化情况 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 基金资助 |
| 已发表与学位论文相关的英文论文 |
| 文献综述 肠道菌群与免疫治疗 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）基于肠道菌群与代谢组学的消癌解毒方抗结肠癌的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1.癌毒理论及消癌解毒方抗肿瘤研究 |
| 1.1 癌毒理论来源 |
| 1.2 癌毒病理因素 |
| 1.3 病位 |
| 1.4 病理性质 |
| 1.5 治则治法 |
| 1.6 选方用药 |
| 1.7 消癌解毒方方药 |
| 1.8 消癌解毒方抗肿瘤的分子机制研究 |
| 2.关于结直肠癌的中医和西医认识 |
| 2.1 中医对结直肠癌的认识 |
| 2.2 西医对结直肠癌的认识 |
| 3.肠道微生物与结直肠癌的关系 |
| 3.1 结直肠癌的发生机制 |
| 3.2 微生物群作为结直肠癌的治疗方法 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 消癌解毒方抑制HCT116移植瘤生长研究 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.小结 |
| 第二章 消癌解毒方干预HCT116移植瘤小鼠肠道菌群的研究 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 第三章 伪无菌HCT116移植瘤小鼠模型的建立及消癌解毒方抗结肠癌效果研究 |
| 1、实验材料 |
| 2、实验方法 |
| 3、实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 消癌解毒方干预HCT116移植瘤小鼠血清代谢组学研究 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 全文总结 |
| 攻读硕士学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（4）功能纳米生物复合物用于癌症免疫治疗（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 癌症免疫治疗的介绍 |
| 1.1.1 肿瘤抗原 |
| 1.1.1.1 肿瘤相关抗原(TAA) |
| 1.1.1.2 肿瘤特异性抗原(TSA) |
| 1.1.2 抗原呈递细胞(APCs) |
| 1.1.2.1 树突细胞(DC) |
| 1.1.2.2 巨噬细胞 |
| 1.1.2.3 单核细胞和B淋巴细胞(B细胞) |
| 1.1.3 T淋巴细胞(T细胞) |
| 1.1.3.1 细胞毒性T细胞 |
| 1.1.3.2 辅助T细胞 |
| 1.1.3.3 调节/抑制性T细胞 |
| 1.1.3.4 记忆T细胞 |
| 1.1.3.5 自然杀伤细胞(NK细胞) |
| 1.2 提高癌症免疫治疗的策略 |
| 1.2.1 增加肿瘤免疫原、降低肿瘤免疫抑制 |
| 1.2.1.1 修饰癌细胞 |
| 1.2.1.2 诱导免疫原性细胞死亡(ICD)增加肿瘤免疫原 |
| 1.2.1.3 癌细胞的免疫检查点抑制 |
| 1.2.2 抗原呈递细胞(APCs)的激活和调控 |
| 1.2.2.1 调节树突细胞 |
| 1.2.2.2 调节巨噬细胞 |
| 1.2.3 对T细胞的调节 |
| 1.2.3.1 激活T细胞 |
| 1.2.3.2 T细胞免疫检查点抑制剂 |
| 1.2.3.3 基因工程改造T细胞 |
| 1.2.3.4 下调调节性T细胞 |
| 1.2.3.5 上调记忆T细胞 |
| 1.2.4 对NK细胞的调节 |
| 1.2.5 对其他免疫细胞的调节 |
| 1.3 本论文的选题背景和研究意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 肿瘤酸性响应、钙离子协同的纳米免疫制剂增强乳腺癌的治疗并防止其复发 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂与仪器 |
| 2.2.2 细胞系和动物 |
| 2.2.3 纳米免疫制剂的制备 |
| 2.2.4 Ca~(2+),IDOi和 CpG ODNs的释放 |
| 2.2.5 酶联免疫吸附实验 |
| 2.2.6 流式细胞术 |
| 2.2.7 淋巴细胞线粒体耗氧量(OCR)测定 |
| 2.2.8 活体实验 |
| 2.2.9 体内生物发光和成像 |
| 2.2.10 统计学分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 CaIPC的合成与表征 |
| 2.3.2 酸性条件下CaIPC的溶解 |
| 2.3.3 CaIPC的生物相容性 |
| 2.3.4 免疫激活 |
| 2.3.5 活体肿瘤治疗实验 |
| 2.3.6 免疫记忆效应的研究 |
| 2.3.7 肿瘤复发实验 |
| 2.4 总结 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于DNA四面体的纳米免疫调节剂通过引发内质网应激暴露免疫原增强肿瘤免疫治疗 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂与仪器 |
| 3.2.2 细胞系和动物 |
| 3.2.3 材料的合成与表征 |
| 3.2.4 蛋白免疫印迹(western blotting)实验 |
| 3.2.5 内质网共定位实验 |
| 3.2.6 检测细胞内活性氧的产生 |
| 3.2.7 内质网应激和ICD的研究 |
| 3.2.8 体内肿瘤靶向实验 |
| 3.2.9 树突细胞成熟与抗原呈递 |
| 3.2.10 活体肿瘤治疗实验 |
| 3.2.11 酶联免疫吸附实验 |
| 3.2.12 统计学分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 Td@Gox-Ts G@C的合成与表征 |
| 3.3.2 Td@Gox-Ts G@C催化性能的研究 |
| 3.3.3 内质网共定位 |
| 3.3.4 细胞内H2O2积累的可视化成像 |
| 3.3.5 内质网应激的研究 |
| 3.3.6 钙网蛋白(CRT)的可视化成像 |
| 3.3.7 高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的可视化成像 |
| 3.3.8 体内肿瘤靶向实验 |
| 3.3.9 活体水平内质网应激和ICD的验证 |
| 3.3.10 树突细胞的成熟与抗原呈递 |
| 3.3.11 活体肿瘤治疗效果研究 |
| 3.4 总结 |
| 参考文献 |
| 第四章 一种类似树突细胞的仿生纳米颗粒增强T细胞活化用于乳腺癌的免疫治疗 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂与仪器 |
| 4.2.2 细胞系和动物 |
| 4.2.3 材料的合成与表征 |
| 4.2.4 T细胞激活实验 |
| 4.2.5 活体肿瘤治疗实验 |
| 4.2.6 活体成像实验 |
| 4.2.7 酶联免疫吸附实验 |
| 4.2.8 统计学分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 DMSNs3@HA的合成与表征 |
| 4.3.2 DMSNs3@HA的生物相容性 |
| 4.3.3 T细胞激活实验 |
| 4.3.4 体内肿瘤靶向实验 |
| 4.3.5 活体肿瘤治疗效果的研究 |
| 4.4 总结 |
| 参考文献 |
| 第五章 基于金属有机框架材料的化疗联合免疫治疗的策略用于乳腺癌治疗 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 试剂与仪器 |
| 5.2.2 细胞系和动物 |
| 5.2.3 材料的合成和表征 |
| 5.2.4 ZIF的溶解实验 |
| 5.2.5 药物的装载和释放 |
| 5.2.6 细胞治疗实验 |
| 5.2.7 细胞免疫原性死亡的验证 |
| 5.2.8 活体肿瘤治疗实验 |
| 5.2.9 统计学分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 ZIF(DAC)-DOX的合成与表征 |
| 5.3.2 ZIF的溶解 |
| 5.3.3 DOX的释放 |
| 5.3.4 细胞治疗实验 |
| 5.3.5 细胞免疫原性死亡的验证 |
| 5.4 总结 |
| 参考文献 |
| 第六章 总结与展望 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文及参与的课题 |
| 致谢 |
（5）粒毛盘菌多糖抗肿瘤作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 真菌多糖的提取 |
| 1.2 真菌多糖的纯化 |
| 1.3 真菌多糖的分级分离 |
| 1.4 真菌多糖的纯度及分子量的测定 |
| 1.5 真菌多糖的生物活性 |
| 1.6 粒毛盘菌多糖研究概况 |
| 1.7 本课题研究的内容与意义 |
| 第二章 粒毛盘菌YM130胞外多糖联合5-氟尿嘧啶体外抗肝癌作用及其机制 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 主要试剂和仪器 |
| 2.2.3 细胞培养 |
| 2.2.4 细胞毒性实验 |
| 2.2.5 细胞形态学观察 |
| 2.2.6 克隆形成实验 |
| 2.2.7 伤口愈合实验 |
| 2.2.8 细胞侵袭与迁移实验 |
| 2.2.9 细胞核形态学分析 |
| 2.2.10 Western blot分析以及核蛋白和胞质蛋白提取方法 |
| 2.2.11 细胞凋亡检测 |
| 2.2.12 细胞中活性氧的检测 |
| 2.2.13 细胞周期分析 |
| 2.2.14 细胞线粒体膜电位测定 |
| 2.2.15 细胞免疫荧光染色 |
| 2.2.16 数据统计与分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 5-FU和LEP130分别对Hep G2、LO2和HSF细胞活力的影响 |
| 2.3.2 5-FU与LEP130联用对Hep G2细胞的协同抑制作用 |
| 2.3.3 5-FU与LEP130联用对Hep G2细胞凋亡的影响 |
| 2.3.4 LEP130细胞存活途径的影响 |
| 2.3.5 LEP130对细胞内活性和抗氧化酶的影响 |
| 2.3.6 LEP130对线粒体凋亡途径的影响 |
| 2.3.7 5-FU与LEP130联用对Hep G2细胞周期的影响 |
| 2.3.8 5-FU与LEP130对p53活化状态和DNA修复的影响 |
| 2.3.9 5-FU与LEP130联用Hep G2细胞迁移与侵袭 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 粒毛盘菌YM130胞外多糖联合环磷酰胺体内抗肝癌作用及其机制 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 主要试剂和仪器 |
| 3.2.3 细胞培养 |
| 3.2.4 H22荷瘤小鼠模型 |
| 3.2.5 动物分组与处理 |
| 3.2.6 生化指标分析 |
| 3.2.7 组织病理学检测 |
| 3.2.8 免疫组化检测 |
| 3.2.9 Western blot分析 |
| 3.2.10 TUNEL染色 |
| 3.2.11 线粒体膜电位检测 |
| 3.2.12 数据统计与分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 CTX与LEP130联用对H22 荷瘤小鼠肿瘤生长的影响 |
| 3.3.2 CTX与LEP130联用对H22 荷瘤小鼠肿瘤组织形态的影响 |
| 3.3.3 CTX与LEP130联用对肿瘤细胞死亡受体途径的影响 |
| 3.3.4 CTX与LEP130联用对肿瘤细胞线粒体凋亡途径的影响 |
| 3.3.5 CTX与LEP130联用对H22 荷瘤小鼠免疫系统的影响 |
| 3.3.6 CTX与LEP130联用对肿瘤组织中免疫细胞和免疫因子的影响 |
| 3.3.7 CTX与LEP130联用对肿瘤组织中存活蛋白的影响 |
| 3.3.8 CTX与LEP130联用对肿瘤组织中血管生成的影响 |
| 3.3.9 LEP130对CTX引起的副作用的影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 粒毛盘菌YM130胞外多糖通过增强机体免疫系统抑制S180荷瘤小鼠肿瘤生长 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 主要试剂和仪器 |
| 4.2.3 细胞培养 |
| 4.2.4 细胞毒性实验 |
| 4.2.5 S180荷瘤小鼠模型 |
| 4.2.6 动物分组与处理 |
| 4.2.7 生化指标分析 |
| 4.2.8 组织病理学检测 |
| 4.2.9 免疫组化检测 |
| 4.2.10 Western blot分析 |
| 4.2.11 免疫荧光双染实验 |
| 4.2.12 Quantitative real-time PCR(q PCR)检测 |
| 4.2.13 小鼠腹腔巨噬细胞(M?)的制备及条件培养基处理 |
| 4.2.14 数据统计与分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 LEP130对S180荷瘤小鼠肿瘤生长的影响 |
| 4.3.2 LEP130对肿瘤微环境中M1、M2型巨噬细胞的影响 |
| 4.3.3 LEP130通过T细胞调节肿瘤微环境中的M1、M2型巨噬细胞的比率 |
| 4.3.4 LEP130对肿瘤特异性辅助性T细胞(Th1)免疫应答的影响 |
| 4.3.5 LEP130对免疫抑制性肿瘤微环境的影响 |
| 4.3.6 LEP130在体外通过TLR4模式识别受体促进原代巨噬细胞向M1 型极化 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 粒毛盘菌YM130胞外多糖抗结肠癌活性与肠道微生物及其代谢物相关性 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 主要试剂和仪器 |
| 5.2.3 CRC小鼠建模与处理 |
| 5.2.4 生化指标分析 |
| 5.2.5 组织病理学检测 |
| 5.2.6 免疫组化检测 |
| 5.2.7 Western blot分析 |
| 5.2.8 粪便中短链脂肪酸的测定 |
| 5.2.9 DNA提取和16S r RNA测序 |
| 5.2.10 测序数据的处理与生物信息学分析 |
| 5.2.11 非靶向代谢组学检测 |
| 5.2.12 代谢组学数据分析 |
| 5.2.13 数据统计与分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 LEP130对AOM/DSS诱导的小鼠结肠癌发生的影响 |
| 5.3.2 LEP130对结肠癌小鼠肠屏障完整性和肠道炎症的影响 |
| 5.3.3 LEP130对结肠癌小鼠肠道菌群整体结构的影响 |
| 5.3.4 LEP130对结肠癌小鼠肠道菌群组成的影响 |
| 5.3.5 LEP130对结肠癌小鼠肠道菌群相关性的影响 |
| 5.3.6 LEP130对结肠癌小鼠代谢组的影响 |
| 5.3.7 LEP130对结肠癌小鼠差异代谢物与肠道菌群相关性的影响 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的学术活动及成果情况 |
（6）NLRP3炎症小体参与食管鳞癌增殖、侵袭和迁移并介导荷瘤小鼠顺铂抵抗（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 引言 |
| 第一部分 NLRP3炎症小体在人食管鳞癌组织中的表达及其临床意义 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 NLRP3炎症小体活化对食管鳞癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响及其作用机制 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 NLRP3炎症小体对荷瘤小鼠顺铂抵抗的实验研究 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 全文结论 |
| 创新性和意义 |
| 局限性 |
| 计划与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 NLRP3炎症小体在癌症中作用及调控机制 |
| 参考文献(综述) |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（7）结直肠癌患者肠道菌群促进Apcmin/+小鼠腺瘤癌变的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 第一部分 结直肠癌患者粪菌液供体筛选及粪菌液制备 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 粪菌液供体的选择 |
| 1.1.2 粪菌液供体的筛查 |
| 1.1.3 主要实验设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 结直肠癌患者及健康者粪菌液制备 |
| 1.2.2 结直肠癌患者及健康者粪菌液检测 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 结直肠癌患者基本情况分析 |
| 1.3.2 结直肠癌患者肿瘤分型情况 |
| 1.3.3 结直肠癌及健康者粪菌液检测情况 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 FMT供体的筛选 |
| 1.4.2 CRC患者和健康者粪菌液供体的选择 |
| 1.4.3 CRC患者和健康者粪菌液的检测 |
| 1.5 小结 |
| 第二部分 结直肠癌患者粪菌移植诱导Apc~(min/+)小鼠肠癌发生 |
| 2.1 实验对象、主要试剂和设备 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要设备和仪器 |
| 2.1.4 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验小鼠的饲养 |
| 2.2.2 动物分组、实验干预及标本留取方法 |
| 2.2.3 实验小鼠肠道腺瘤的大体观察及病理组织学观察 |
| 2.2.4 免疫组织化学染色 |
| 2.2.5 Realtime-PCR技术 |
| 2.2.6 Western blot技术 |
| 2.2.7 Apc~(min/+)小鼠回盲部粪便短链脂肪酸水平 |
| 2.2.8 Apc~(min/+)小鼠肠道菌群检测 |
| 2.3 统计学方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 FMT对 Apc~(min/+)小鼠基本情况的影响 |
| 2.4.2 FMT对各组小鼠肠道腺瘤的影响 |
| 2.4.3 FMT对肿瘤细胞增殖的影响 |
| 2.4.4 FMT对各组小鼠肠道屏障功能的影响 |
| 2.4.5 FMT对 Apc~(min/+)小鼠肠道低度炎症的影响 |
| 2.4.6 FMT对 Apc~(min/+)小鼠肠道肿瘤信号分子活化情况 |
| 2.4.7 FMT对 Apc~(min/+)小鼠肠道短链脂肪酸浓度的影响 |
| 2.4.8 FMT对 Apc~(min/+)小鼠肠道菌群的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 Apc基因在结直肠癌中的多重作用 |
| 2.5.2 肠道炎症与结直肠癌的发生 |
| 2.5.3 肠屏障在结直肠癌发展中的作用 |
| 2.5.4 短链脂肪酸在结肠癌中的作用 |
| 2.5.5 肠道菌群与结直肠癌的关系 |
| 2.6 小结 |
| 第三部分 FMT对 Apc~(min/+)小鼠结直肠腺瘤癌变发生相关基因探讨 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验对象 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 文库构建 |
| 3.2.2 总RNA的质量控制 |
| 3.2.3 生物信息学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 数据概况 |
| 3.3.2 差异基因筛选 |
| 3.3.3 差异基因功能注释和富集分析 |
| 3.3.4 KEGG信号通路分析 |
| 3.3.5 基因互作网络分析 |
| 3.3.6 生存分析 |
| 3.3.7 ESR1与肿瘤免疫浸润淋巴细胞的相关性分析 |
| 3.3.8 ESR1与PDCD1及LRRC32 的相关性分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 GO分析讨论 |
| 3.4.2 结直肠癌中RNA-seq分析 |
| 3.4.3 肿瘤组织免疫细胞浸润与结直肠癌的发生 |
| 3.5 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 肠道菌群在结肠癌发生过程中的作用机制 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）薏苡附子败酱对肠道腺瘤的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 薏苡附子败酱散对APC~(Min/+)小鼠肠道腺瘤的影响 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 试剂的配制 |
| 1.5 中药复方的提取 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 薏苡附子败酱散药物活性成分分析 |
| 2.2 APC~(Min/+)小鼠繁殖 |
| 2.3 APC~(Min/+)小鼠基因型鉴定 |
| 2.4 APC~(Min/+)小鼠实验分组和给药方案 |
| 2.5 APC~(Min/+)小鼠的一般情况观察和体重测定 |
| 2.6 APC~(Min/+)小鼠解剖和取材 |
| 2.7 APC~(Min/+)小鼠肠道组织病理观察 |
| 2.8 APC~(Min/+)小鼠肠道组织Ki67、PCNA蛋白免疫组化检测 |
| 2.9 统计分析 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 薏苡附子败酱散成分分析结果 |
| 3.2 APC~(Min/+)小鼠基因型鉴定结果 |
| 3.3 本实验设计 |
| 3.4 APC~(Min/+)小鼠生长情况 |
| 3.5 APC~(Min/+)小鼠肠道腺瘤生物学特征及形成规律 |
| 3.6 薏苡附子败酱散对APC~(Min/+)小鼠肠道腺瘤组织病理的影响 |
| 3.7 薏苡附子败酱散对APC~(Min/+)小鼠肠道腺瘤Ki67、PCNA蛋白表达的影响 |
| 4.分析与讨论 |
| 第二部分 薏苡附子败酱散对APC~(Min/+)小鼠T淋巴细胞的影响及相关因子的调节作用 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 小鼠外周血及组织的获得 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 试剂配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 APC~(Min/+)小鼠脾脏指数 |
| 2.2 APC~(Min/+)小鼠脾淋巴细胞分离 |
| 2.3 APC~(Min/+)小鼠肠系膜取材以及细胞制备 |
| 2.4 APC~(Min/+)小鼠小肠固有层淋巴细胞的分离 |
| 2.5 流式细胞仪检测APC~(Min/+)小鼠淋巴细胞Treg细胞比例 |
| 2.6 ELISA 法检测小鼠血清细胞因子 |
| 2.7 荧光定量PCR检测APC~(Min/+)小鼠T淋巴细胞相关转录因子 |
| 2.8 统计方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 薏苡附子败酱散对APC~(Min/+)小鼠脾脏指数的影响 |
| 3.2 薏苡附子败酱散对APC~(Min/+)小鼠Treg细胞表达的影响 |
| 3.3 薏苡附子败酱散对APC~(Min/+)小鼠脾、肠系膜、小肠固有层 Treg 细胞表达的影响 |
| 4.分析讨论 |
| 第三部分 薏苡附子败酱散对大肠癌细胞生长的影响和对APC~(Min/+)小鼠脾脏淋巴细胞的调节作用 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 CCK-8法检测薏苡附子败酱散对大肠癌细胞生长的作用. |
| 2.3 分离APC~(Min/+)小鼠脾淋巴细胞 |
| 2.4 分离APC~(Min/+)小鼠外周血淋巴细胞 |
| 2.5 台盼蓝方法检测薏苡附子败酱对APC~(Min/+)小鼠淋巴细胞增殖的作用 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 薏苡附子败酱散对HCT116细胞增殖的影响 |
| 3.2 薏苡附子败酱散对MC-38细胞增殖的影响 |
| 3.3 薏苡附子败酱散对APC~(Min/+)小鼠脾淋巴细胞的影响 |
| 3.4 薏苡附子败酱散对APC~(Min/+)小鼠外周血淋巴细胞的影响 |
| 4.分析讨论 |
| 第四部分 薏苡附子败酱散调节肿瘤细胞生长的机制探讨 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 试剂配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 CD4~+CD25~+Treg淋巴细胞分选 |
| 2.2 收集薏苡附子败酱散与APC~(Min/+)小鼠Treg细胞的上清 |
| 2.3 台盼蓝实验检测薏苡附子败酱和Treg细胞上清对MC-38 细胞增殖的影响 |
| 2.4 克隆形成实验检测薏苡附子败酱和Treg细胞上清对MC-38细胞增殖的影响 |
| 2.5 Western blot实验检测薏苡附子败酱和Treg细胞上清对MC-38 细胞Ki67、PCNA蛋白表达的影响 |
| 2.6 统计方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 薏苡附子败酱和Treg细胞上清对MC-38 细胞增殖的影响 |
| 3.2 薏苡附子败酱和Treg细胞上清对MC-38 细胞克隆形成的影响 |
| 3.3 薏苡附子败酱和Treg细胞上清对MC-38 细胞Ki67,PCNA蛋白表达的影响 |
| 4.分析讨论 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 文献综述 CD4~+T 淋巴细胞与肿瘤发生 |
| 参考文献 |
| 论文发表及获奖情况 |
（9）卵巢癌干细胞疫苗抗卵巢癌疗效及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号、变量、缩略词等本论文专用术语注释表 |
| 绪论 |
| 一、研究背景 |
| 二、研究的创新点和意义 |
| 三、参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 第一章 人源性卵巢癌干细胞疫苗的抗肿瘤效应及机制 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第二章 人源性卵巢癌干细胞疫苗机制探究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第三章 鼠源性卵巢癌干样细胞疫苗机制探究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（10）LincRNA-p21调控TAMs的功能参与抗肿瘤免疫应答的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 TAMs(tumor-associated macrophages) |
| 1.1.1 TAMs的来源及分类 |
| 1.1.2 TAMs的活化 |
| 1.1.3 TAMs促进肿瘤发展的机制 |
| 1.1.4 TAMs与相关信号通路 |
| 1.1.5 TAMs的靶向治疗 |
| 1.2 长链非编码RNA(long noncoding RNA,LncRNA) |
| 1.2.1 LncRNA的概述及分类 |
| 1.2.2 LncRNA的作用机制 |
| 1.2.3 LncRNA在炎症中的作用 |
| 1.3 研究目的、研究方法、实验设计及意义 |
| 1.3.1 研究目的 |
| 1.3.2 研究方法 |
| 1.3.3 实验设计 |
| 1.3.4 实验意义 |
| 第二章 肿瘤微环境调控巨噬细胞lincRNA-p21 表达的改变 |
| 2.1 实验材料和仪器 |
| 2.1.1 实验细胞株和实验动物 |
| 2.1.2 实验仪器和耗材 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 FVB/N-Tg(MMTV-PyVT)/Nju自发乳腺癌小鼠乳腺肿瘤组织玻片免疫荧光 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 LncRNA表达芯片的检测与分析 |
| 2.2.4 LncRNA表达水平的检测 |
| 2.2.5 RAW264.7 的转染及转染效率的检测 |
| 2.2.6 统计学分析与图像 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 小鼠乳腺癌组织中浸润巨噬细胞的检测 |
| 2.3.2 LncRNA在正常巨噬细胞和肿瘤上清处理的巨噬细胞中的差异表达 |
| 2.3.3 LincRNA-p21在4T1 肿瘤上清处理过的RAW264.7 中高表达 |
| 2.3.4 RAW264.7 转染si-lincRNA-p21 后转染效率的验证 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 LincRNA-p21 表达下调对巨噬细胞的影响 |
| 3.1 实验材料和仪器 |
| 3.1.1 实验细胞株及实验动物 |
| 3.1.2 实验仪器与耗材 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 主要溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 CCK-8 检测细胞增殖 |
| 3.2.2 FCM检测转染后巨噬细胞表面标记的改变 |
| 3.2.3 FCM检测敲减lincRNA-p21后RAW264.7 的凋亡情况 |
| 3.2.4 ELISA检测敲减lincRNA-p21后RAW264.7 分泌谱的改变 |
| 3.2.5 RAW264.7 吞噬功能的检测 |
| 3.2.6 小鼠脾脏组织单核细胞的分离 |
| 3.2.7 Western-blot检测敲减lincRNA-p21的RAW264.7中Arg-1和iNOS的表达情况 |
| 3.2.8 统计学方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 敲低lincRNA-p21对RAW264.7 增殖的影响 |
| 3.3.2 敲低lincRNA-p21 对巨噬细胞凋亡的影响 |
| 3.3.3 敲低lincRNA-p21对RAW264.7 表达表面标记的影响 |
| 3.3.4 敲低lincRNA-p21对RAW264.7 分泌谱的影响 |
| 3.3.5 敲低lincRNA-p21对RAW264.7 表达Arg-1和iNOS蛋白的影响 |
| 3.3.6 敲低lincRNA-p21对RAW264.7 吞噬功能的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 敲低lincRNA-p21 的巨噬细胞对肿瘤细胞的影响 |
| 4.1 实验材料和仪器 |
| 4.1.1 实验细胞株 |
| 4.1.2 实验仪器和耗材 |
| 4.1.3 实验试剂 |
| 4.1.4 主要溶液配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 CCK-8 检测细胞增殖 |
| 4.2.2 FCM检测肿瘤细胞与敲减lincRNA-p21的RAW264.7 共培养后的凋亡情况 |
| 4.2.3 FCM检测肿瘤细胞与敲减lincRNA-p21的RAW264.7 共培养后巨噬细胞表面FasL和肿瘤细胞表面Fas的表达情况 |
| 4.2.4 FCM检测肿瘤细胞与敲减lincRNA-p21的RAW264.7 共培养后巨噬细胞ROS的表达情况 |
| 4.2.5 Transwell检测与敲减lincRNA-p21的RAW264.7 共培养后肿瘤细胞迁移能力的变化 |
| 4.2.6 划痕实验检测与敲减lincRNA-p21的RAW264.7 共培养后肿瘤细胞侵袭能力的变化 |
| 4.2.7 统计学方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 与敲减lincRNA-p21的RAW264.7 共培养后肿瘤细胞增殖的变化 |
| 4.3.2 与敲减lincRNA-p21的RAW264.7 共培养后肿瘤细胞凋亡情况 |
| 4.3.3 与敲减lincRNA-p21的RAW264.7 共培养后肿瘤细胞迁移能力的变化 |
| 4.3.4 与敲减lincRNA-p21的RAW264.7 共培养后对肿瘤细胞侵袭能力的变化 |
| 4.3.5 肿瘤细胞与转染RAW264.7 共培养后对巨噬细胞表达ROS及表面标记FasL和肿瘤细胞表达Fas的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 巨噬细胞lincRNA-p21 表达下调对小鼠乳腺癌移植瘤的生长的影响及其机制 |
| 5.1 实验材料和仪器 |
| 5.1.1 实验细胞株和实验动物 |
| 5.1.2 实验仪器和耗材 |
| 5.1.3 实验试剂 |
| 5.1.4 主要溶液配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠4T1 乳腺癌皮下移植瘤的建立 |
| 5.2.2 转染后RAW264.7 处理小鼠4T1 乳腺癌移植瘤模型 |
| 5.2.3 小鼠生存状况的检测、小鼠肿瘤体积的检测及小鼠肿瘤重量的检测 |
| 5.2.4 FCM分选荷瘤小鼠肿瘤组织中TAMs |
| 5.2.5 小鼠脾脏组织单核细胞的分离 |
| 5.2.6 小鼠脾脏组织及肿瘤组织中巨噬细胞lincRNA-p21 表达水平的检测 |
| 5.2.7 Western-blot检测敲减lincRNA-p21的RAW264.7 下游相关蛋白及相关信号通路的表达情况 |
| 5.2.8 FISH探针检测lincRNA-p21与p53及MDM2 相互作用的情况 |
| 5.2.9 统计学分析与图像 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 原代脾脏巨噬细胞及TAMs中 lincRNA-p21 的表达 |
| 5.3.2 巨噬细胞lincRNA-p21 表达的减低对荷瘤小鼠皮下瘤发展的影响 |
| 5.3.3 巨噬细胞lincRNA-p21 表达的减低对其相互作用蛋白及其下游相关蛋白以及相关信号通路蛋白表达的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的文章 |
四、E.coli DNA抗肿瘤免疫的动态实验研究（论文参考文献）
- [1]肺癌源性吲哚胺2,3-双加氧酶1在T细胞耗竭中的作用及其抗癌免疫治疗的实验研究[D]. 尚可. 南昌大学, 2021(01)
- [2]第一部分：基于胆汁DNA中突变和甲基化的平行分析建立胆胰系统恶性肿瘤辅助诊断模型 第二部分：肠道微生物中有益菌群与晚期胸部肿瘤患者接受抗PD-1免疫治疗疗效相关性的研究[D]. 殷慧慧. 北京协和医学院, 2021
- [3]基于肠道菌群与代谢组学的消癌解毒方抗结肠癌的机制研究[D]. 谢辉. 南京中医药大学, 2021(01)
- [4]功能纳米生物复合物用于癌症免疫治疗[D]. 李艳华. 山东师范大学, 2020(02)
- [5]粒毛盘菌多糖抗肿瘤作用及其机制研究[D]. 宗帅. 合肥工业大学, 2020(01)
- [6]NLRP3炎症小体参与食管鳞癌增殖、侵袭和迁移并介导荷瘤小鼠顺铂抵抗[D]. 于爽. 郑州大学, 2020(02)
- [7]结直肠癌患者肠道菌群促进Apcmin/+小鼠腺瘤癌变的研究[D]. 李晓飞. 天津医科大学, 2020(06)
- [8]薏苡附子败酱对肠道腺瘤的作用及机制研究[D]. 顾凯娟. 上海中医药大学, 2019
- [9]卵巢癌干细胞疫苗抗卵巢癌疗效及机制研究[D]. 吴迪. 东南大学, 2019(05)
- [10]LincRNA-p21调控TAMs的功能参与抗肿瘤免疫应答的研究[D]. 周李宁. 江苏大学, 2019(03)