论文摘要
作为自体免疫性疾病未经治疗的Graves’病患者血中存在的TRAb，与TSH一样也能与TSHR结合，并产生一系列生物学效应，是引起Graves’病主要和直接的原。为了研究TRAb的来源，因此需制备TSH抗体以进行后续实验。TSH由α和β两条链组成。α链的氨基酸顺序与促黄体激素、促卵泡激素，绒毛膜促性腺激素的α链相似，被认为是上述激素所共有；β链的顺序与以上三种激素的β链完全不同，因此TSH的特异性功能主要体现在β链。为了制备TSH抗体，有必要先获得大鼠TSHβ以免疫动物。在实验研究中，多选用大鼠制作甲状腺功能亢进和甲状腺功能减退的动物模型。通过检测血清中甲状腺激素和TSH的含量证实动物模型的建立是否成功。目前检测大鼠血清中TSH含量的方法，多采用人促甲状腺激素（TSH）定量检测试剂盒。因此，获得一定量的大鼠TSH进而开发大鼠TSH的定量检测试剂盒很有应用价值。本研究我们提取大鼠肝脏组织的基因组DNA为模板，采用巢式PCR和外显子拼接法相结合的方法克隆大鼠TSHβ链编码基因的外显子序列，克隆入pGEM-T Easy载体。测序证实序列正确后，将目的基因插入融合型原核表达载体pQE-30Xa和pGEX-5X-1后，分别转化入E．coli M15[pREP4]和E．coli BL21，进行融合表达。SDS-PAGE电泳查看表达产物大小和表达量，Western-blotting进一步鉴定。将重组质粒pQE-30Xa／TSHβ优化表达条件进行大量表达，TSHβ的表达量达到6mg／L培养基。重组蛋白TSHp占菌体蛋白的24.32％。目的蛋白含6×His纯化标签，可以经金属螯合亲和层析吸附于Ni-IDA树脂层析柱，冲洗除去非特异吸附的杂蛋白后，将目的蛋白洗脱，利用Ni-IDA蛋白纯化层析柱对大量表达产物进行蛋白纯化。
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标签：促甲状腺激素论文; 融合表达论文; 巢式论文; 重叠延伸论文; 促甲状腺激素受体论文;