人bFGF的克隆及其对HeLa细胞生长和血管生成素表达的影响

论文摘要

宫颈癌是世界女性第二大恶性肿瘤。已经有实验证实血管新生与宫颈癌患者预后不良有关。有多个血管生成因子参与肿瘤血管发生过程,其中主要的有VEGF、bFGF和血管生成素。bFGF是可以与肝素结合的多功能多肽家族的成员之一。它具有促血管生成的作用,它也在多种肿瘤的增殖和分化中发挥重要作用。研究发现多种恶性肿瘤都高表达bFGF。有学者研究显示宫颈癌患者的血清中bFGF含量增高。血管生成素是唯一一个以促血管发生的功能而命名的血管生成因子。血管生成素在内皮细胞可以发生核转移,进而促进内皮细胞的增殖。血管生成素在HeLa细胞中也有核转移现象,并且能够在细胞核内促进rRNA的合成。目前对于bFGF和血管生成素的研究主要集中在其如何诱发肿瘤的血管发生,进而促进肿瘤的进一步生长和恶化,以及它们在肿瘤预后评价中的相关作用。而对于二者的关系的研究比较少。有学者发现,应用血管生成素的反义核苷酸可以抑制体外培养的HeLa细胞和体内的肿瘤细胞的生长,但是细胞和肿瘤内的bFGF表达增加。本实验室前期的研究发现,在转染血管生成素反义核苷酸的黑色素瘤细胞中,bFGF的表达增加,而在转染血管生成素正义核苷酸的黑色素瘤细胞中,bFGF的表达降低。为了进一步的研究bFGF与血管生成素的关系,我们克隆了人bFGF基因,并且构建了含有人bFGF基因的正义和反义的真核表达载体,建立了稳定表达bFGF的细胞株。进而探讨在HeLa细胞中,利用bFGF基因的转染改变细胞内源的bFGF基因的表达水平对血管生成素表达的影响。实验结果显示,在转染反义bFGF基因的bFGF低表达细胞株中,细胞表达的bFGF的mRNA和蛋白都降低,细胞的增殖受到了抑制,但是血管生成素的蛋白表达水平却提高了。相反,在转染正义bFGF基因的bFGF高表达的细胞株中,细胞表达的bFGF的mRNA和蛋白均增加,同时细胞的增殖增加,然而血管生成素的的蛋白表达水平下降了。但是,高表达和低表达bFGF的细胞的血管生成素的mRNA水平无显著性差异。对HeLa细胞及高表达bFGF和低表达bFGF的细胞,施加外源的血管生成素后,HeLa细胞和转染反义bFGF基因的低表达bFGF的细胞株,细胞增殖加速,而转染正义bFGF基因的高表达bFGF的细胞株的细胞增殖无改变。实验结果表明,bFGF和血管生成素均可以直接刺激HeLa细胞的增殖。证明外源bFGF基因的转染导致细胞内源bFGF水平发生改变,这一改变负性地影响细胞内源血管生成素蛋白的表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 一、研究背景和立题依据
• 二、本文的研究内容和意义
• 第二章 文献综述
• 第三章 材料与方法
• 一、实验材料
• （一） 细胞和质粒
• （二） 主要试剂
• （三） 主要仪器
• 二、实验方法
• （一） 哺乳动物细胞培养
• （二） 哺乳动物细胞总RNA 的提取
• （三） 逆转录PCR （RT-PCR）
• （四） 人碱性成纤维细胞因子基因的克隆
• （五） 人碱性成纤维细胞生长因子的真核表达载体pCI-bFGF（+/-）的构建
• （六） 大提质粒
• （七） 哺乳动物细胞转染
• （八） 哺乳动物细胞基因组的提取及PCR
• （九） 酶联免疫吸附实验
• （十） SDS-PAGE电泳及Western Blotting
• （十一） 免疫荧光实验
• （十二） 流式细胞术
• （十三） MTT
• 第四章 实验结果与分析
• 一、含人碱性成纤维细胞生长因子基因的真核表达载体的构建
• 二、转染方法的确定
• 三、稳定转染bFGF 的细胞株的获得
• （一） 质粒的制备及电穿孔转染与筛选
• （二） 阳性细胞克隆的鉴定
• 四、外源bFGF 基因的转染对细胞内源bFGF 表达的影响
• （一） 外源bFGF 基因的转染对内源的bFGF 的mRNA 表达的影响
• （二） 外源bFGF 基因的转染对细胞bFGF 蛋白表达水平的影响
• 五、bFGF 基因的转染对细胞增殖的影响
• 六、外源bFGF 基因的转染改变内源的bFGF 的表达对血管生成素的影响
• （一） 内源bFGF 表达水平改变对细胞内血管生成素mRNA 表达的影响
• （二） 内源bFGF 表达水平改变对细胞血管生成素蛋白表达的影响
• 七、外源血管生成素对转染bFGF 细胞的细胞增殖的影响
• 第五章 讨论
• 一、人碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体的构建
• 二、外源bFGF 基因的转入对细胞内源bFGF 表达的影响
• （一） 稳定转染细胞系的建立
• （二） 外源 bFGF 基因的转染影响细胞内源 bFGF 的表达
• 三、bFGF 对 HeLa 细胞的增殖具有促进作用
• 四、内源的bFGF 表达水平在转录后水平负性地影响血管生成素的表达
• 五、外源血管生成素对转染bFGF 基因的细胞的增殖的影响
• 结论
• 创新点
• 参考文献
• 附录 英文缩写词
• 致谢
• 作者简介
• 在学期间公开发表论文及著作情况
• 在读期间参加科研项目情况