鼻咽纤维血管瘤血管内皮细胞比正常血管内皮细胞具有更强的迁移和侵袭能力

论文摘要

鼻咽纤维血管瘤,又称青少年鼻咽纤维血管瘤（juvenile nasopharyngeal angiofibroma, JNA）是鼻咽部良性肿瘤中最常见的一种,约占总头颈部肿瘤的0.5%,主要发生于14-25岁的青少年男性。尽管JNA组织学上呈良性表型,但其没有包膜,而且具有局部侵袭和破坏性恶性表型,可以累及鼻腔、鼻咽部、鼻窦、翼腭窝、颞下窝、翼突以及前颅底组织等。JNA没有特异性的药物治疗手段,放射疗法的使用尚存在争议,外科手术切除仍然是目前最常用的治疗方法。近年来,随着耳鼻喉科临床治疗手段的长足进步,特别是术前栓塞和鼻内镜技术的使用,使得大部分患者获得了较好的预后,但是JNA术后高复发率（可高达50%）仍是一个极大的挑战。目前关于JNA术后高复发的原因和相关的临床预测指标研究甚少,可能与JNA向周围颅底骨质侵袭,手术难以彻底切除有关。如能阐明引起JNA局部侵袭及术后复发的因素及其分子调节机制,将进一步改善JNA患者的预后。肿瘤血管生成与包括JNA在内的多种肿瘤生长和局部侵袭密切相关。但是目前基于JNA血管生成及其分子机制研究不多,特别是针对内皮细胞本身的功能研究更少,关键在于缺乏直接来源于肿瘤标本并可用于体外培养的血管内皮工具细胞。本课题首先分析血管内皮标记物CD105在JNA组织芯片（tissue microarray, TMA）微血管内皮细胞中的表达及其临床意义,进一步通过免疫磁珠分选（magnetic activated cell sorting, MACS）人JNA的血管内皮细胞进行传代培养,检测肿瘤血管内皮细胞及正常血管内皮细胞间的功能差异并探讨其差异的分子机制,以期阐明导致JNA高复发的原因及可能机制,并以此寻找新的复发干预途径,进一步提高疗效。第一部分血管内皮标记物CD105在鼻咽纤维血管瘤组织芯片微血管中的表达及其临床意义目的：通过构建组织芯片并运用免疫组织化学染色的方法明确CD105蛋白在JNA微血管中的表达,并分析其与JNA临床病理特征以及复发之间的关系。方法：通过免疫组织化学染色方法在一套独立的组织芯片（包括70例JNA患者的肿瘤组织）中检测了CD105的表达情况,进行微血管计数,并分析其与年龄、JNA手术史、手术方式、肿瘤分期、术中出血等临床病理特征的关系,同时进一步分析微血管密度（microvessel density, MVD）与JAN患者临床病理参数及至复发时间（time to recurrence, TTR）的相关性。结果：免疫组织化学检测结果显示,CD105仅表达于血管内皮细胞中,在间质中未见明显表达。卡方检验分析发现微血管数目高低与肿瘤复发显著相关（P=0.013）。Kaplan-Meier生存分析和log-rank检验显示,低微血管密度患者的TTR显著高于高微血管密度患者（P=0.009）。多因素回归模型结果也提示,微血管密度是一个决定JNA预后的独立因素（P=0.01）。结论：CD105染色的肿瘤微血管密度可以预测JNA患者术后复发,提示血管生成在JNA发生发展进程中可能起重要作用,有望成为JNA治疗靶点和预后预测指标。同时,为将CD105做为分离JNA血管内皮细胞的表面标记提供了临床依据。第二部分人鼻咽纤维血管瘤血管内皮细胞分选、鉴定与培养目的：分选、鉴定及传代培养人鼻咽纤维血管瘤血管内皮细胞。方法：采用抗CD105抗体交联免疫磁珠,通过免疫磁珠分选法,对JNA组织进行血管内皮细胞分选；采用流式细胞术检测阳性分选细胞的纯度。通过细胞免疫化学法检测von Willebrand factor （vWF,又称Ⅷ因子）的表达,并通过乙酰化低密度脂蛋白摄取实验及小管生成实验验证阳性分选细胞是否具有血管内皮细胞的功能。结果：流式检测阳性分选细胞的CD105表达高达99%以上；细胞免疫化学检测显示阳性分选细胞中Ⅷ因子表达为阳性,超过95%的阳性分选细胞乙酰化低密度脂蛋白摄取实验阳性；分选细胞在基质胶中可形成毛细管结构。同时可将阳性分选细胞进行传代培养至10代以上,其内皮细胞特性仍存在。结论：通过免疫磁珠分选（MACS）法,我们成功分选获得高纯度的CD105阳性鼻咽纤维血管瘤血管内皮细胞（CD105+ juvenile nasopharyngeal angiofibroma-derived endothelial cell, CD105+ JEC）,并能够成功传代培养,为后续研究提供了细胞平台。第三部分鼻咽纤维血管瘤血管内皮细胞与正常血管内皮细胞的功能比较目的：比较JNA组织中分离的CD105阳性内皮细胞与人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell, HUVEC）的功能差异。方法：采用CyQUANT法增殖实验、划痕实验及Transwell侵袭实验对比观察两种细胞体外的增殖、侵袭和迁移能力的异同；通过免疫荧光观察细胞骨架蛋白肌动蛋白纤维（F-actin）的表达和细胞内定位分布的差异,运用Western blot检测基质金属蛋白酶-2 （matrix metalloproteinase-2, MMP-2）及血管内皮细胞生长因子受体（Vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR）相关信号通路蛋白表达水平异同。结果：增殖实验发现CD105+JEC的增殖能力低于HUVEC；而划痕实验、侵袭实验及F-actin荧光染色显示CD105+JEC的迁移和侵袭能力高于HUVEC; Western blot结果显示VEGFR1、p-MAPK、MMP-2在CD105+JNA血管内皮细胞中的表达高于HUVEC,而VEGFR2、p-ERK的表达则相反。结论：CD105+JEC比HUVEC具有更强的体外迁移、侵袭能力,其机制可能与VEGFR相关信号通路的差异性活化有关。

论文目录

• 英文缩略语注释
• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 第一部分 血管内皮标记物CD105在鼻咽纤维血管瘤组织芯片微血管中的表达及其临床意义
• 摘要
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 人鼻咽纤维血管瘤血管内皮细胞的分选、鉴定与培养
• 摘要
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 鼻咽纤维血管瘤血管内皮细胞与正常血管内皮细胞的功能比较
• 摘要
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 结论
• 潜在应用价值
• 创新点
• 文献综述
• 参考文献
• 附件
• 致谢