本文主要研究内容
作者郭尚轩（2019）在《黑曲霉cbsA与cysA在抗氧化和菌植互作中的机制研究》一文中研究指出：黑曲霉（Aspergillus niger）是曲霉属真菌中的一个常见菌种,既是重要的工业发酵菌种,同时也是导致粮食和果蔬霉变的致病性真菌。真菌病原体侵染植物体时,植物宿主细胞会启动防御机制如活性氧自由基的爆发来限制病原菌的生长,同时病原菌会激活体内的抗氧化酶类和抗氧化物质,确保自身不会受到植物免疫应答带来的损伤,抗氧化酶和抗氧化物质在菌植互作中的机制研究一直是学者关注的课题。cbsA（An05g00160）和cysA（An12g09880）是黑曲霉中分别编码胱硫醚-β-合成酶和半胱氨酸合成酶的基因,它们与生物体内重要的抗氧化物质半胱氨酸、H2S的代谢密切相关,但在抗氧化及菌植互作中所起到的作用尚不清楚。本文以黑曲霉为实验材料,利用同源重组的技术原理,构建黑曲霉cbsA和cysA敲除载体,用PEG转化黑曲霉原生质体,通过基因组PCR和qRT-PCR的方法鉴定得到突变菌株ΔcbsA和ΔcysA。以突变菌株ΔcbsA和黑曲霉A.niger MA70.15（野生型）为材料开展以下工作。首先,在正常培养条件下,cbsA缺失不影响黑曲霉的生长而在GMM（缺乏氨基酸）培养基上生长时,发现ΔcbsA生长的菌落较小,表明cbsA是氨基酸依赖性酶。通过检测黑曲霉中半胱氨酸、GSH含量,发现ΔcbsA中半胱氨酸、GSH的含量相比WT分别提高了0.28倍和0.94倍;另外利用BiGGY agar显色培养基检测硫化氢的生成,发现WT菌落比ΔcbsA菌落的颜色更深,表明cbsA的缺失降低了黑曲霉中H2S的释放量。在0.5mM CdCl2的胁迫条件下,WT的菌斑直径要明显小于ΔcbsA,培养第四天时,WT的菌落直径甚至不足ΔcbsA的一半,这表明cbsA在镉胁迫下的氧化应激反应中是一个负调节因子,然而甲萘醌、硫酸锰、氟康唑处理条件下,ΔcbsA突变体和野生型相比,没有明显差异。孢子萌发实验中,在0.5mM Cd下生长24h,对照菌株的孢子萌发率仅为45.1%,而cbsA的孢子萌发率达到71.3%,进一步表明cbsA的缺失使黑曲霉抗Cd胁迫的能力增强。将WT和ΔcbsA的孢子悬浮液接种在梨果实上,cbsA缺失导致梨果实侵染直径大于野生型,增强了黑曲霉对梨的致病性,表明cbsA是黑曲霉侵染果实的负调节因子。在WT和ΔcbsA接种的果实组织中检测了?O2–、H2O2和MDA的含量,发现与WT相比,ΔcbsA侵染梨果实后,果实组织中?O2–、H2O2和MDA的含量得到了提高,表现出更强的ROS响应,表明cbsA缺失诱导梨果实更强的应答过程。cbsA的缺失可以增加半胱氨酸Cys的含量,降低H2S的释放量,于是我们推测cbsA在黑曲霉中具有催化Cys生成H2S的功能,为验证推测,我们成功构建了黑曲霉cbsA的原核表达载体,并且在番茄中找到与cbsA同源性最高的CS、CSX1作为参考。在蛋白酶学性质实验中我们发现,cbsA、CS和CSX1都可以催化Cys生成H2S,且诱导后的cbsA催化能力提高了1.4倍。半胱氨酸合成酶是合成半胱氨酸的限速酶,其合成的半胱氨酸在抗逆方面起重要作用,但是cysA否参与黑曲霉的抗逆应答和在菌植互作中起到的功能,尚不清楚。黑曲霉有6个编码半胱氨酸合成酶的基因,所有蛋白质都含有保守的吡哆醛-磷酸依赖性酶特征的结构域PALP结构域。在GMM培养基中生长,发现ΔcysA突变体表现出较小的菌落,表明cysA也是氨基酸依赖性酶。在CdCl2、AlCl3,甲萘醌,ZnSO4,Pb（NO3）2,MnCl2,NaCl和H2O2非生物胁迫下,WT和ΔcysA的菌落直径中未发现明显差异,表明cysA可能不参与对黑曲霉在胁迫条件下的应激反应。在侵染梨和苹果的实验中,显示WT和ΔcysA之间的病变直径没有显著差异,因此得出,cysA的缺失不会影响黑曲霉对梨和苹果的侵染能力。检测WT和ΔcysA半胱氨酸合成酶的活性与半胱氨酸含量,cysA缺失对黑曲霉整体的半胱氨酸合酶活性和半胱氨酸含量没有显著影响,表明cysA不是参与半胱氨酸合成的关键基因,这可能是由于基因功能冗余造成的。定量qRT-PCR显示,和WT相比,ΔcysA突变体中编码半胱氨酸合酶的基因中An14g00960、An15g00160和An02g10750的表达水平分别提高了1.5倍、0.3倍和0.75倍。因此,我们推测其他半胱氨酸合成酶基因的上调表达可以补偿cysA的缺失,也就是说黑曲霉中可能存在对半胱氨酸合酶基因表达的负反馈调节。总结:基因cbsA的缺失导致黑曲霉内半胱氨酸含量的积累,提高了抗镉胁迫的能力和侵染梨果实的能力。原核表达的酶学性质结果显示:cbsA可以催化Cys生成H2S。cysA缺失后,不影响黑曲霉的抗氧化和侵染果实能力,qRT-PCR结果显示,黑曲霉中编码半胱氨酸合成酶的基因An14g00960、An15g00160和An02g10750表达水平上调,所以推测黑曲霉中可能存在对半胱氨酸合酶基因表达的负反馈调节。
Abstract
hei qu mei （Aspergillus niger）shi qu mei shu zhen jun zhong de yi ge chang jian jun chong ,ji shi chong yao de gong ye fa jiao jun chong ,tong shi ye shi dao zhi liang shi he guo shu mei bian de zhi bing xing zhen jun 。zhen jun bing yuan ti qin ran zhi wu ti shi ,zhi wu su zhu xi bao hui qi dong fang yu ji zhi ru huo xing yang zi you ji de bao fa lai xian zhi bing yuan jun de sheng chang ,tong shi bing yuan jun hui ji huo ti nei de kang yang hua mei lei he kang yang hua wu zhi ,que bao zi shen bu hui shou dao zhi wu mian yi ying da dai lai de sun shang ,kang yang hua mei he kang yang hua wu zhi zai jun zhi hu zuo zhong de ji zhi yan jiu yi zhi shi xue zhe guan zhu de ke ti 。cbsA（An05g00160）he cysA（An12g09880）shi hei qu mei zhong fen bie bian ma guang liu mi -β-ge cheng mei he ban guang an suan ge cheng mei de ji yin ,ta men yu sheng wu ti nei chong yao de kang yang hua wu zhi ban guang an suan 、H2Sde dai xie mi qie xiang guan ,dan zai kang yang hua ji jun zhi hu zuo zhong suo qi dao de zuo yong shang bu qing chu 。ben wen yi hei qu mei wei shi yan cai liao ,li yong tong yuan chong zu de ji shu yuan li ,gou jian hei qu mei cbsAhe cysAqiao chu zai ti ,yong PEGzhuai hua hei qu mei yuan sheng zhi ti ,tong guo ji yin zu PCRhe qRT-PCRde fang fa jian ding de dao tu bian jun zhu ΔcbsAhe ΔcysA。yi tu bian jun zhu ΔcbsAhe hei qu mei A.niger MA70.15（ye sheng xing ）wei cai liao kai zhan yi xia gong zuo 。shou xian ,zai zheng chang pei yang tiao jian xia ,cbsAque shi bu ying xiang hei qu mei de sheng chang er zai GMM（que fa an ji suan ）pei yang ji shang sheng chang shi ,fa xian ΔcbsAsheng chang de jun la jiao xiao ,biao ming cbsAshi an ji suan yi lai xing mei 。tong guo jian ce hei qu mei zhong ban guang an suan 、GSHhan liang ,fa xian ΔcbsAzhong ban guang an suan 、GSHde han liang xiang bi WTfen bie di gao le 0.28bei he 0.94bei ;ling wai li yong BiGGY agarxian se pei yang ji jian ce liu hua qing de sheng cheng ,fa xian WTjun la bi ΔcbsAjun la de yan se geng shen ,biao ming cbsAde que shi jiang di le hei qu mei zhong H2Sde shi fang liang 。zai 0.5mM CdCl2de xie pai tiao jian xia ,WTde jun ban zhi jing yao ming xian xiao yu ΔcbsA,pei yang di si tian shi ,WTde jun la zhi jing shen zhi bu zu ΔcbsAde yi ban ,zhe biao ming cbsAzai ge xie pai xia de yang hua ying ji fan ying zhong shi yi ge fu diao jie yin zi ,ran er jia nai kun 、liu suan meng 、fu kang zuo chu li tiao jian xia ,ΔcbsAtu bian ti he ye sheng xing xiang bi ,mei you ming xian cha yi 。bao zi meng fa shi yan zhong ,zai 0.5mM Cdxia sheng chang 24h,dui zhao jun zhu de bao zi meng fa lv jin wei 45.1%,er cbsAde bao zi meng fa lv da dao 71.3%,jin yi bu biao ming cbsAde que shi shi hei qu mei kang Cdxie pai de neng li zeng jiang 。jiang WThe ΔcbsAde bao zi xuan fu ye jie chong zai li guo shi shang ,cbsAque shi dao zhi li guo shi qin ran zhi jing da yu ye sheng xing ,zeng jiang le hei qu mei dui li de zhi bing xing ,biao ming cbsAshi hei qu mei qin ran guo shi de fu diao jie yin zi 。zai WThe ΔcbsAjie chong de guo shi zu zhi zhong jian ce le ?O2–、H2O2he MDAde han liang ,fa xian yu WTxiang bi ,ΔcbsAqin ran li guo shi hou ,guo shi zu zhi zhong ?O2–、H2O2he MDAde han liang de dao le di gao ,biao xian chu geng jiang de ROSxiang ying ,biao ming cbsAque shi you dao li guo shi geng jiang de ying da guo cheng 。cbsAde que shi ke yi zeng jia ban guang an suan Cysde han liang ,jiang di H2Sde shi fang liang ,yu shi wo men tui ce cbsAzai hei qu mei zhong ju you cui hua Cyssheng cheng H2Sde gong neng ,wei yan zheng tui ce ,wo men cheng gong gou jian le hei qu mei cbsAde yuan he biao da zai ti ,bing ju zai fan jia zhong zhao dao yu cbsAtong yuan xing zui gao de CS、CSX1zuo wei can kao 。zai dan bai mei xue xing zhi shi yan zhong wo men fa xian ,cbsA、CShe CSX1dou ke yi cui hua Cyssheng cheng H2S,ju you dao hou de cbsAcui hua neng li di gao le 1.4bei 。ban guang an suan ge cheng mei shi ge cheng ban guang an suan de xian su mei ,ji ge cheng de ban guang an suan zai kang ni fang mian qi chong yao zuo yong ,dan shi cysAfou can yu hei qu mei de kang ni ying da he zai jun zhi hu zuo zhong qi dao de gong neng ,shang bu qing chu 。hei qu mei you 6ge bian ma ban guang an suan ge cheng mei de ji yin ,suo you dan bai zhi dou han you bao shou de bi chi quan -lin suan yi lai xing mei te zheng de jie gou yu PALPjie gou yu 。zai GMMpei yang ji zhong sheng chang ,fa xian ΔcysAtu bian ti biao xian chu jiao xiao de jun la ,biao ming cysAye shi an ji suan yi lai xing mei 。zai CdCl2、AlCl3,jia nai kun ,ZnSO4,Pb（NO3）2,MnCl2,NaClhe H2O2fei sheng wu xie pai xia ,WThe ΔcysAde jun la zhi jing zhong wei fa xian ming xian cha yi ,biao ming cysAke neng bu can yu dui hei qu mei zai xie pai tiao jian xia de ying ji fan ying 。zai qin ran li he ping guo de shi yan zhong ,xian shi WThe ΔcysAzhi jian de bing bian zhi jing mei you xian zhe cha yi ,yin ci de chu ,cysAde que shi bu hui ying xiang hei qu mei dui li he ping guo de qin ran neng li 。jian ce WThe ΔcysAban guang an suan ge cheng mei de huo xing yu ban guang an suan han liang ,cysAque shi dui hei qu mei zheng ti de ban guang an suan ge mei huo xing he ban guang an suan han liang mei you xian zhe ying xiang ,biao ming cysAbu shi can yu ban guang an suan ge cheng de guan jian ji yin ,zhe ke neng shi you yu ji yin gong neng rong yu zao cheng de 。ding liang qRT-PCRxian shi ,he WTxiang bi ,ΔcysAtu bian ti zhong bian ma ban guang an suan ge mei de ji yin zhong An14g00960、An15g00160he An02g10750de biao da shui ping fen bie di gao le 1.5bei 、0.3bei he 0.75bei 。yin ci ,wo men tui ce ji ta ban guang an suan ge cheng mei ji yin de shang diao biao da ke yi bu chang cysAde que shi ,ye jiu shi shui hei qu mei zhong ke neng cun zai dui ban guang an suan ge mei ji yin biao da de fu fan kui diao jie 。zong jie :ji yin cbsAde que shi dao zhi hei qu mei nei ban guang an suan han liang de ji lei ,di gao le kang ge xie pai de neng li he qin ran li guo shi de neng li 。yuan he biao da de mei xue xing zhi jie guo xian shi :cbsAke yi cui hua Cyssheng cheng H2S。cysAque shi hou ,bu ying xiang hei qu mei de kang yang hua he qin ran guo shi neng li ,qRT-PCRjie guo xian shi ,hei qu mei zhong bian ma ban guang an suan ge cheng mei de ji yin An14g00960、An15g00160he An02g10750biao da shui ping shang diao ,suo yi tui ce hei qu mei zhong ke neng cun zai dui ban guang an suan ge mei ji yin biao da de fu fan kui diao jie 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自合肥工业大学的郭尚轩，发表于刊物合肥工业大学2019-09-20论文，是一篇关于黑曲霉论文,非生物胁迫论文,致病性论文,合肥工业大学2019-09-20论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自合肥工业大学2019-09-20论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
标签：黑曲霉论文; 非生物胁迫论文; 致病性论文; 合肥工业大学2019-09-20论文;