犬用干扰素的制备方法研究及质量体系建立

论文摘要

近年来,犬作为宠物,在人们的生活中扮演着越来越重要的角色,而各种病毒性疾病是造成犬类死亡的主要原因。干扰素是由感染病毒的细胞或其它生物诱导剂刺激机体合成的一类天然蛋白质。主要功能为抗病毒、免疫激活和细胞生长调节。犬干扰素具有广谱抗病毒活性,能够治疗犬瘟热、犬细小病毒病、犬病毒性肝炎等高致死性病毒病,并辅助肿瘤治疗。所以设计合成犬用干扰素具有很好的应用前景。本研究根据大肠杆菌密码子偏好性对犬干扰素α（CaIFN-α）基因序列进行密码子优化,并由上海生物工程有限公司合成。构建重组质粒pBV220-CaIFN-α,转化E.coliBL21,30℃培养42℃诱导表达CaIFN-α蛋白,蛋白分子量约为18KD,最佳诱导时间为5h,发酵培养表达量为25%。表达菌体经超声破碎得包涵体,再经洗涤、变性和复性后蛋白纯度为69%,收率为28%；经疏水层析纯化后CaIFN-α蛋白纯度87%,收率为81%；经分子筛层析纯化后CaIFN-α蛋白纯度为96%,收率为90%。利用MDCK（犬肾细胞）-VSV（水疱性口炎）病毒体系,测定纯化的CaIFN-α蛋白的生物学比活性为3×107IU/mg,内毒素为≤10EU/mg,符合兽用药要求。此制备方法总产率高达20%、重现性好,适用于大规模生产。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 课题研究背景及意义
• 1.2 干扰素简介
• 1.3 干扰素的诱导表达
• 1.4 干扰素的生物学功能及其作用机制
• 1.5 犬干扰素的生物学功能及研究进展
• 第二章 实验材料
• 2.1 主要试剂及实验仪器
• 2.2 常用试剂配制
• 2.3 表达载体,宿主菌,病毒及细胞
• 第三章 实验方法
• 3.1 CaIFN-α基因片段的合成
• 3.2 CaIFN-α基因在大肠杆菌中的表达
• 3.3 CaIFN-α蛋白的纯化
• 3.4 不同批次CaIFN-α蛋白的制备
• 第四章 实验结果
• 4.1 CaIFN-α基因合成及重组质粒构建结果
• 4.2 CaIFN-α蛋白诱导表达结果
• 4.3 CaIFN-α蛋白纯化结果
• 4.4 CaIFN-α蛋白纯化样品浓度的测定结果
• 4.5 CaIFN-α蛋白纯化样品的比活性计算
• 4.6 CaIFN-α蛋白纯化各步骤质量检测结果
• 4.7 不同批次制备CaIFN-α的质量检测
• 讨论
• 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介
• 攻读硕士学位期间研究成果