GluCl受体在小菜蛾对阿维菌素抗性中的作用研究

论文摘要

小菜蛾是十字花科蔬菜上一种非常重要的世界性害虫。阿维菌素作为一种高效低毒的抗生素类杀虫剂,对小菜蛾具有很好的杀虫效果。但是由于大范围的长期单一使用,致田间小菜蛾很快对其产生了抗性。GluCl受体是阿维菌素的主要作用靶标,GluCl受体在小菜蛾对阿维菌素抗性中的作用尚不清楚。本研究通过室内抗药性筛选、不同抗性品系GluCl a亚基基因差异位点分析、以及GluCl a亚基基因相对表达量的测定,来阐明GluCl受体在小菜蛾对阿维菌素抗性中的作用。一、小菜蛾对阿维菌素的室内抗性筛选小菜蛾最初采于福建田间,在室内饲养约5年后用阿维菌素进行抗性汰选。本实验是在前期已进行汰选2年的基础上继续选育,抗性倍数由20.85倍上升到218.92倍,达到了较高的抗性水平。该种群在最初筛选的两年时间里,抗性发展非常缓慢。但是随着汰选次数的逐渐增加,抗性个体的比率显著上升。二、不同抗性水平的小菜蛾GluCla亚基基因的差异位点分析分别克隆了室内汰选的福建抗性品系(对阿维菌素的抗性倍数是180倍),广州抗性品系(对阿维菌素的抗性倍数是30倍),田间采集的广东惠州种群(对阿维菌素的抗性倍数是217倍)、云南弥渡种群(对阿维菌素的抗性倍数是513倍)、云南通海种群(对阿维菌素的抗性倍数是680倍)以及海南种群(对阿维菌素的抗性倍数是534倍)小菜蛾GluCla亚基基因。对所获得的多个拷贝序列GluCla亚基基因进行序列比对后发现,共有16个位点发生了核苷酸的变异,其中只有4个位点引起了氨基酸的变异,其他位置还有序列的替换、缺失和插入。这些变异中,四个氨基酸的变异只是同时出现在室内饲养的广州汰选和福建汰选种群中,在其他抗性种群中没有发现,其他三个位置的序列替换、缺失和插入变异则普遍存在各抗性种群中,各种群之间没有明显的差异。三、不同抗性水平的小菜蛾GluCla亚基基因的相对表达量分析采用实时荧光定量的方法,分别对福建敏感品系和福建抗性品系小菜蛾卵、一龄、二龄、三龄、四龄幼虫的GluCla亚基基因进行了表达量分析,结果证明在所检测的各个龄期中,不论是福建敏感品系还是福建抗性品系,一龄小菜蛾GluCla亚基基因表达量最高,但抗性和敏感种群各龄期之间的差异以四龄幼虫为最大,达到7.47倍。同时还对田间采集的小菜蛾云南弥渡种群、云南通海种群、北京南口种群,进行了GluCla亚基基因表达量分析,结果表明各个田间种群相比于福建敏感品系均表现出更高水平的GluCla亚基基因表达量。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 中英文缩略表
• 第一章 绪论
• 1.1 小菜蛾概况
• 1.2 小菜蛾抗药性研究进展
• 1.2.1 小菜蛾抗药性的发生现状
• 1.2.2 小菜蛾抗药性形成与发展的机制
• 1.2.3 小菜蛾的抗药性综合治理
• 1.3 阿维菌素研究概况
• 1.3.1 阿维菌素的作用机理
• 1.3.2 害虫对阿维菌素的抗药性和交互抗性
• 1.3.3 害虫对阿维菌素的抗性遗传方式及分子机制研究
• 1.4 谷氨酸受体的研究进展
• 1.4.1 GluCl受体的分子特性
• 1.4.2 GluCl受体的生理功能
• 1.5 研究目的与意义
• 第二章 阿维菌素对小菜蛾的抗性筛选
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 供试昆虫
• 2.1.2 供试药剂
• 2.2 主要研究方法
• 2.2.1 小菜蛾的饲养
• 2.2.2 阿维菌素抗性小菜蛾的汰选
• 2.2.3 小菜蛾的生物测定
• 2.3 结果与分析
• 2.4 讨论
• 第三章 小菜蛾GluClα亚基基因的克隆和序列分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 供试昆虫
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 主要试剂及试剂盒
• 3.1.4 培养基及常用溶液
• 3.1.5 引物和测序
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 总RNA提取
• 3.2.2 RNA检测
• 3.2.3 cDNA合成
• 3.2.4 cDNA合成效率的内参检测
• 3.2.5 小菜蛾GluClα亚基全长序列的克隆
• 3.2.6 PCR产物的回收与纯化
• 3.2.7 PCR纯化产物与pEASY-T1载体的连接
• 3.2.8 PCR纯化产物与pEASY-T1载体的转化
• 3.2.9 阳性克隆检测
• 3.2.10 序列测定
• 3.2.11 生物信息学分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 小菜蛾总RNA的提取
• 3.3.2 Actin检测cDNA效果
• 3.3.3 cDNA全长序列的验证
• 3.3.4 小菜蛾GluClα亚基cDNA测序结果及推测的氨基酸序列
• 3.4 GluClα推测的氨基酸生物信息学分析
• 3.4.1 氨基酸序列信号肽分析
• 3.4.2 GluClα推导氨基酸二级结构预测
• 3.4.3 GluClα氨基酸跨膜结构预测
• 3.4.4 G1uClα编码蛋白的氨基酸组成
• 3.4.5 GluClα推导氨基酸亲脂性分析
• 3.4.6 GluClα蛋白的分子量及等电点
• 3.5 讨论
• 第四章 抗性品系小菜蛾GluClα亚基基因克隆和变异位点分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 供试昆虫
• 4.1.2 主要仪器
• 4.1.3 主要试剂及试剂盒
• 4.1.4 培养基及常用溶液
• 4.1.5 引物和测序
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 总RNA提取
• 4.2.2 RNA检测
• 4.2.3 cDNA合成
• 4.2.4 cDNA合成效率的内参检测
• 4.2.5 不同品系小菜蛾GluClα亚基全长序列的克隆
• 4.2.6 PCR产物的回收与纯化
• 4.2.7 PCR纯化产物与pEASY-T1载体的连接
• 4.2.8 PCR纯化产物与pEASY-T1载体的转化
• 4.2.9 阳性克隆检测
• 4.2.10 序列测定
• 4.2.11 突变点分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 测序结果比对
• 4.3.2 不同抗性水平小菜蛾种群GluClα基因差异分析
• 4.4 讨论
• 第五章 不同品系小菜蛾GluClα亚基基因的表达量分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 供试昆虫
• 5.1.2 主要仪器
• 5.1.3 主要试剂及试剂盒
• 5.1.4 培养基及常用溶液
• 5.1.5 引物和测序
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 总RNA提取
• 5.2.2 cDNA合成
• 5.2.3 实时荧光定量PCR引物的设计
• 5.2.4 内参基因的克隆
• 5.2.5 实时荧光定量PCR条件的优化
• 5.3 结果分析
• 5.3.1 总RNA的提取
• 5.3.2 cDNA的合成
• 5.3.3 传统PCR验证引物特异性
• 5.3.4 β-Actin引物的内参验证
• 5.3.5 qRT-PCR条件的优化
• 5.3.6 标准曲线和扩增曲线的建立
• 5.3.7 扩增曲线的建立
• 5.3.8 熔解曲线的建立
• 5.3.9 可重复性GluCl基因表达差异的检测
• 5.3.10 田间小菜蛾种群GluClα相对表达量的测定
• 5.3.11 抗Bt种群小菜蛾GluClα基因表达量测定
• 5.4 讨论
• 第六章 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历