体细胞核移植山羊遗传鉴定及核移植山羊和牛全基因组DNA甲基化研究

论文摘要

体细胞核移植动物的生产,在基础理论研究和应用研究方面,如农业、遗传资源的保护和人类医学等,均具有广阔的应用前景。微卫星DNA(microsatellite DNA)随机、广泛地分布于真核生物基因组中,具有多态性丰富、共显性和可使用PCR方法进行方便地检测等优点,是亲子鉴定和个体身份鉴定的首选分子标记。鉴于此,微卫星技术也经常用来对体细胞核移植个体进行遗传鉴定。DNA甲基化是体细胞核移植克隆中体细胞核“表观遗传重编程”的一个重要方面。大量研究表明DNA甲基化重编程在附植前的克隆胚胎中发生了异常,且研究发现附植后克隆胎儿的甲基化与人工授精胎儿相比也呈现出显著变异,这些可能与克隆效率低下和克隆动物多发的各种机体缺陷有关。因此,从基因组水平对克隆动物DNA甲基化进行研究,有助于了解体细胞核移植动物发育异常和表观遗传修饰的关系,也可为体细胞克隆技术的改进提供参考。本研究包括两部分内容:第一部分:以2个已知无亲缘关系的鲁北白山羊个体,对36个微卫星位点进行扩增和聚丙烯酰胺凝胶分析,筛选出了10个多态性高的位点用于3只体细胞核移植山羊与其供核细胞遗传同一性的鉴定及与其受体母羊间母子关系的排除。结果发现分别在9(C1)、10(C2)和9个(F)位点上克隆山羊的基因型与受体母羊的不同而与供体核细胞的相同,证实了克隆山羊是由体细胞克隆而来。第二部分:首次采用MSAP的方法,以自然繁殖个体为对照,在基因组水平上分别对3只体细胞核移植山羊和3头体细胞核移植牛进行DNA甲基化分析,并在体细胞核移植山羊和核移植牛个体中分别找到28处和10处差异的甲基化位点并测序。所测得的28个克隆山羊的差异序列与牛数据库中的序列具有很高的同源性,其中有15个序列与牛数据库中序列的同源性达92%以上,覆盖差异序列的长度几乎达100%;大部分差异序列主要与牛数据库中一些GNOMON预测的结构基因的内含子具有很高的同源性。所测得的10个克隆牛的差异序列有7个与牛数据库中序列的同源性在97%~100%之间,覆盖差异序列的长度也几乎达100%,有4个差异序列属间隔DNA或无特征的基因组序列,另外一些差异序列为GNOMON预测的结构基因内含子的一部分。将所得序列与所有物种的基因组进行比对时发现,差异序列主要与一些散布序列具有很高的同源性,同源序列长度在20bp以上,同源性80%~100%不等。基于牛基因组数据库,对克隆牛10个差异甲基化位点分别进行HpaⅡ敏感PCR分析验证(7个位点)和BSP分析验证(3个位点),最终证明克隆个体在其中5个位点(C1、C2、C9、C11和C16)甲基化程度明显下降。总而言之,本研究在体细胞核移植牛的基因组上鉴定了几个差异甲基化位点,但这些位点与体细胞克隆动物发育异常的关系还需做进一步研究。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 1 体细胞核移植
• 1.1 体细胞核移植的研究现状与应用前景
• 1.2 微卫星在体细胞核移植动物的遗传鉴定中的应用
• 2 体细胞核移植技术成功率低的原因
• 2.1 DNA 甲基化和染色质重塑与体细胞克隆
• 2.2 基因组印记和基因表达重编程与体细胞克隆
• 2.3 X 染色体失活与体细胞克隆
• 3 DNA 甲基化及其作用机理
• 3.1 DNA 甲基转移酶与甲基化的CpG 结合蛋白
• 3.2 DNA 甲基化对哺乳动物基因表达的调控机制
• 4 DNA 甲基化的研究方法
• 4.1 基于凝胶的甲基化分析方法
• 4.2 基于微阵列的甲基化分析方法
• 4.3 亚硫酸氢盐处理-PCR 测序
• 4.4 生物信息学的分析方法
• 5 体细胞核移植技术的改进
• 5.1 体外培养条件及对供体细胞核的处理
• 5.2 供体细胞类型和核移植方案
• 6 本研究的目的和意义
• 第一部分 利用多态微卫星标记进行体细胞核移植山羊的遗传鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 山羊基因组DNA 的提取
• 2.2 多态微卫星标记的筛选
• 2.3 3只体细胞核移植山羊、供核细胞及其受体母羊的基因型分析
• 3 讨论
• 第二部分 体细胞核移植山羊和牛全基因组DNA 甲基化的比较研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 基因组DNA 的提取
• 2.2 甲基化敏感的扩增多态性试验结果
• 2.3 甲基化差异位点的HpaⅡ敏感PCR 分析验证
• 2.4 甲基化差异位点的亚硫酸氢盐处理－测序分析验证
• 3 讨论
• 3.1 基因组水平甲基化分析方法的选择
• 3.2 DNA 甲基化改变与克隆动物发育异常的关系
• 3.3 甲基化差异位点验证
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表论文情况