内蒙古甘草内生细菌多样性研究

论文摘要

本文以甘草为研究材料,运用传统的分离培养方法并结合非培养方法PCR-DGGE技术,对采自内蒙古鄂尔多斯地区的野生及栽培甘草的不同部位内生细菌的多样性进行了研究,比较了野生及栽培甘草不同部位内生细菌群落的多样性差异,并获得了一批内生细菌菌株资源。对野生及栽培甘草根、茎、叶组织中的内生细菌进行分离和计数,发现野生及栽培甘草根、茎、叶部位的内生细菌菌落数分布在3.10×102～1.37×106 （单位:cfu/g鲜重）上,总体来说,野生甘草内生细菌菌落数大于栽培甘草,内生细菌在甘草根、茎、叶部位的菌落数和种群数量均有差异,野生及栽培甘草均表现出根和叶部的内生细菌种类比茎部丰富。应用分子方法ERIC-PCR方法对分离内生细菌进行菌株水平的多样性检测,共得到内生细菌121株。对其中82株进行16S rDNA片段测序分析,结果表明这些内生细菌分别与Genbank中α、β、γ-Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria五类细菌中的19个已知属相似性达到97-100%。其中γ-Proteobacteria和Firmicutes最多,分别占45.78%和42.17%,剩余的12.05%为其余三类。内生细菌的主要优势种群为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）、假单胞菌属（Pseudomonas sp.）、泛菌属（ Pantoea sp.）和沙雷氏菌属（Serratia sp.）。对同一批甘草样品进表面灭菌后,以CTAB法提取植物基因组DNA,用引物799f-1492r扩增细菌16S rDNA片段,应用变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术对内生细菌菌群多样行进行分析。DGGE指纹图谱显示野生及栽培甘草不同生长部位的优势内生细菌较为相似,个别部位有其特有的优势菌。对其中的1-9号亮度较高的条带回收并克隆测序,显示他们与Genbank中γ-Proteobacteria类细菌中的Enterobacter sp.、Pantoea sp.、Klebsiella oxytoca、Serratia sp.相似性达到97%-100%。采用变性梯度凝胶电泳（DGGE）方法对可培养内生细菌及非培养内生细进行比对分析,结果显示可培养细菌的DGGE条带未能与基因组内生细菌中的条带产生很好的对应,可培养内生细菌样品条带分布在凝胶中较高浓度梯度区域,而非培养内生细菌条带的范围则分布在较低浓度梯度区域。在野生和栽培的根、茎、叶六组样品中,仅有栽培茎（CS）中的分离菌株CS1b可以与其非培养内生细菌中的的9号条带（Pantoea agglomerans）很好的对应。对可培养内生细菌进行16S rDNA片段测序后,发现在Genbank中与菌株WS10b相匹配的菌株多为非培养细菌。应用生理生化、APi 20E、Biolog细菌鉴定系统、16S rDNA全序列测定等多种方法对其进一步鉴定,初步确定其属于肠杆菌科的泛菌属,对其是否是新种的确定还需进一步研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 植物内生细菌
• 1.1.1 植物内生细菌生物多样性
• 1.1.2 植物内生细菌功能多样性
• 1.2 植物内生细菌的研究方法
• 1.2.1 培养方法
• 1.2.2 非培养方法
• 1.3 甘草
• 1.3.1 甘草价值
• 1.3.2 甘草研究现状
• 1.4 立论依据及研究内容
• 1.4.1 立论依据
• 1.4.2 研究内容及技术路线
• 第二章 培养方法对甘草内生细菌多样性研究
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 土壤特性
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 植物内生细菌的分离培养
• 2.2.2 分离细菌的DNA 提取
• 2.2.3 分离细菌的ERIC-PCR 扩增
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 甘草内生细菌分离、纯化结果
• 2.3.2 分离细菌DNA 提取结果
• 2.3.4 ERIC-PCR 图谱结果及分析
• 2.4 讨论
• 第三章 非培养方法研究甘草非培养内生细菌多样性
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 主要试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 植物基因组DNA 的提取（谢中稳，1999）
• 3.2.2 细菌16S rDNA 的 PCR 扩增
• 3.2.3 PCR 产物的变性梯度凝胶电泳
• 3.2.4 DGGE 条带的回收和重新扩增
• 3.2.5 DGGE 回收条带的克隆和转化
• 3.2.6 DGGE 条带的序列测定和同源性比较
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 甘草基因组 DNA 的提取
• 3.3.2 内生细菌16S rDNA 片段的PCR 扩增及纯化
• 3.3.3 甘草内生细菌 PCR 产物的DGGE 垂直胶分离
• 3.3.4 水平 DGGE 对甘草内生细菌群落多样性分析
• 3.3.5 DGGE 回收条带的克隆和转化及阳性克隆的筛选
• 3.3.6 DGGE 条带的序列测定和同源性比较结果
• 3.4 讨论
• 第四章 培养方法与非培养方法在甘草内生细菌研究中的差异
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 分离细菌DNA 及基因组 DNA
• 4.1.2 主要试剂
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 分离细菌16S rDNA 片断扩增
• 4.2.2 分离细菌PCR 产物 DGGE 分析
• 4.2.3 基因组细菌16S rDNA 的PCR 扩增
• 4.2.4 分离细菌PCR 产物及基因组细菌16S rDNA 的PCR 产物的DGGE 对比分析
• 4.2.5 分离细菌序列测定及同源性分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 分离细菌 16S rDNA 片断扩增
• 4.3.2 分离细菌 PCR 产物DGGE 分析
• 4.3.3 分离细菌 PCR 产物及基因组细菌16S rDNA 的PCR 产物的DGGE 对比分析
• 4.3.4 分离细菌序列测定及同源性分析
• 4.4 讨论
• 第五章 一株甘草内生分离细菌的鉴定
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 分离菌株
• 5.1.2 主要试剂
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 菌落及菌体形态观察
• 5.2.2 生理生化分析
• 5.2.3 Api 20E 细菌鉴定系统分析
• 5.2.4 Biolog 微生物自动鉴定系统分析
• 5.2.5 16S rDNA 全序列测定及同源性分析
• 5.2.6 聚类分析
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 形态特征
• 5.3.2 生理生化鉴定
• 5.3.3 WS10b 16S rDNA 全序列测定结果及聚类分析
• 5.4 讨论
• 第六章 全文总结与展望
• 参考文献
• 附录 实验中所用的试剂配方及主要仪器设备
• 致谢
• 作者简历