hPROKR2受体C末端相互作用蛋白的筛选与功能研究

论文摘要

G蛋白偶联受体（G-protein coupled receptors, GPCRs）是迄今发现最大的受体超家族,其家族成员超过1000个。GPCRs一般包括7个跨膜区,3个细胞内环区（IL1-3）和位于胞浆的C末端。几乎所有细胞都表达种类多样的GPCRs,它们与配体结合后激活G蛋白,从而启动不同的信号通路并引起各种生物学效应。GPCRs不仅能与G蛋白相互作用,也与一些称做GPCRs互作蛋白（GPCR interacting proteins, GIPs）的辅助蛋白相互作用。GIPs非常丰富,包括跨膜蛋白、离子通道、离子型受体、单次跨膜蛋白以及多种可溶性蛋白。这些蛋白质参与GPCRs的转运、靶向归巢、信号传导以及变构调节等。GIPs中较多的是与GPCRs的C末端相互作用。PROKR2属于GPCR家族成员之一,与相应配体一PK1或PK2结合后,可参与平滑肌收缩、血管生成、近日节律调节、以及促进神经干细胞迁移。最近的遗传学研究表明PROKR2的突变与卡尔曼综合征（Kallmann Syndrome, KS）以及特发性促性腺激素型性腺功能减退（Isolated hypogonadotropic hypogonadism, IHH）发病有关。KS和IHH表现为青春发育延迟和不孕。因此,研究与PROKR2相互作用的蛋白,不仅可以增强对PROKR2功能调节的了解,而且可以促进一些KS/IHH目关基因的发现。在本研究中,我们利用酵母双杂交技术,以人PROKR2的C末端（333-384aa）为饵,从人cDNA文库中筛选与之相互作用的蛋白。我们首先获得了8个有意义的cDNA克隆,从中我们选取SNAPIN进行进一步的研究。我们通过GST pulldown和免疫共沉淀实验不仅证实了PROKR2与SNAPIN的相互作用,而且发现SNAPIN也可以与PROKR2的同源蛋白PROKR1的C末端相互作用。进一步的研究表明SNAPIN中包含aa37-136的片段为相互作用所必须,该区域包含H1和H2两个α螺旋区。而PROKR2的C-末端的343YFK345和351HWR353是相互作用所必须。免疫共沉淀实验显示,将343YFK345和351HWR353突变成丙氨酸之后得到的突变受体6A-PROKR2不能与SNAPIN相互作用。PROKR2与配体结合之后导致受体内吞,去掉配体之后,受体又可以迅速返回细胞膜。由于SNAPIN参与细胞内的囊泡运输,我们推测SNAPIN与PROKR2的相互作用可能参与了受体的内吞或者重新上膜。RNA干扰内源性SNAPIN之后,PROKR2的内吞不受影响,但是受体重新上膜受到抑制。相应地,受体降解速度增加。这些现象也在SNAPIN结合缺陷的6A-PROKR2得到验证。因此,我们的结果显示SNAPIN促进了PROKR2的重新回膜。本研究得出以下结论：（1）通过酵母双杂交、GST pulldown以及免疫共沉淀,我们筛选到一个PROKR2相互作用蛋白-SNAPIN;（2）SNAPIN的相互作用区域位于aa37-136.其中包含H1和H2两个α螺旋区；（3）PROKR2的C-末端的343YFK345和351HWR353是其与SNAPIN相互作用所必需。YFK与HWR均为两个芳香族氨基酸,紧接一个碱性氨基酸。（4）功能学研究表明SNAPIN有助于PROKR2内吞之后的重新上膜。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 符号说明
• 前言
• 1 酵母双杂交筛选hPROKR2分子C末端相互作用蛋白
• 1.1 实验材料与试剂
• 1.1.1 主要实验仪器
• 1.1.2 主要实验试剂与耗材
• 1.1.3 主要试剂的配制
• 1.1.4 实验用的细胞、质粒和菌种
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 pGBKT7-hPROKR2-C末端表达载体的构建
• 1.2.2 酵母感受态的制备和转化
• 1.2.3 hPROKR2-C末端表达的蛋白毒性和自活性检测
• 1.2.4 pGBKT7-hPROKR2 C末端质粒成功转入酵母中的验证
• 1.2.5 酵母菌株的冻存
• 1.2.6 酵母双杂交及文库的筛选
• 1.2.7 相互作用阳性克隆的筛选
• 1.2.8 文库中与hPROKR2-C末端表达的蛋白相互作用片段质粒的提取
• 1.2.9 筛选到有意义人cDNA文库质粒的自活性验证
• 1.2.10 GST pull down验证hPROKR2 C末端与SNAPIN的相互作用
• 1.2.11 免疫共沉淀（CO-IP）验证实验
• 1.2.12 激光共聚焦显微镜检测hPROKR2与SNAPIN的共定位
• 1.3 实验结果
• 1.3.1 pGBKT7-hPROKR2-C末端表达载体的构建
• 1.3.2 酵母感受态的制备和转化
• 1.3.3 hPROKR2-C末端表达的蛋白毒性和自活性检测
• 1.3.4 pGBKT7-hPROKR2C末端质粒成功转入酵母中的验证
• 1.3.5 酵母双杂交及文库的筛选
• 1.3.6 相互作用阳性克隆的筛选
• 1.3.7 筛选到人cDNA文库质粒的自活性验证
• 1.3.8 体内体外对hPROKR2与SNAPIN相互作用的验证
• 1.3.9 免疫荧光验证hPROKR2与SNAPIN的相互作用
• 1.4 分析与讨论
• 1.5 结论
• 2 hPROKR2 C末端（333-384aa）与SNAPIN相互作用结构域的筛查
• 2.1 实验材料与试剂
• 2.1.1 主要实验仪器
• 2.1.2 主要实验试剂与耗材
• 2.1.3 主要试剂的配制
• 2.1.4 实验用细胞和质粒
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 hPROKR2同源分子hPROKRl与SNAPIN的相互作用
• 2.2.2 寻找SNAPIN不同功能区与PROKRs相互作用位点
• 2.2.3 hPROKR2 C末端与SNAPIN相互作用位点的寻找
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 hPROKR2同源分子hPROKR1与SNAPIN的相互作用
• 2.3.2 寻找SNAPIN不同功能区与PROKRs相互作用位点
• 2.3.3 hPROKR2 C末端与SNAPIN相互作用位点的寻找
• 2.4 分析与讨论
• 2.5 结论
• 3 SNAPIN协助hPROKR2分子的再循环
• 3.1 实验材料与试剂
• 3.1.1 主要实验仪器
• 3.1.2 主要实验试剂与耗材
• 3.1.3 主要试剂的配制
• 3.1.4 实验用细胞与质粒
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 PK2的制备及功效评价
• 3.2.2 RNAi质粒的构建及验证
• 3.2.3 6A-hPROKR2-GFP（343YFK/AAA345,351HWR/AAA353）质粒的构建.
• 3.2.4 hPROKR2（wt）-GFP和6A-hPROKR2-GFP的测活
• 3.2.5 激光共聚焦显微镜检测hPROKR2分子野生型（SNAPIN沉默与否）与6A-hPROKR2分子在PK2刺激内吞与上膜的差异
• 3.2.6 hPROKR2蛋白的降解
• 3.2.7 统计学方法
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 PK2的制备
• 3.3.2 RNAi质粒的构建及验证
• 3.3.3 6A-hPROKR2-GFP质粒的构建
• 3.3.4 测活
• 3.3.5 免疫荧光结果统计
• 3.3.6 hPROKR2蛋白的降解
• 3.4 分析与讨论
• 3.5 结论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 攻读学位期间主要成果
• 致谢
• 附录