微生物法发酵生产L-精氨酸的研究

论文摘要

本论文应用代谢控制发酵原理,系统地研究了L-精氨酸产生菌的选育、代谢流量分析以及摇瓶发酵条件等,主要研究内容和结果如下:以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum） GWY020为出发菌株,经化学和物理诱变处理,用精氨酸甲基酯（AE）、磺胺胍（SG）、D-精氨酸（D-Arg）、脯氨酸（Pro）及琥珀酸（Suc）为唯一碳源平板定向筛选,成功选育出一株L-精氨酸产生菌GUI089（AEr, SGr, Sucg, D-Argr, Pros）。在以葡萄糖为碳源、硫酸铵为氮源的培养基中发酵90h,产酸可达19.27g/L。建立并完善了谷氨酸棒杆菌GWY020及其2个逐步叠加不同遗传标记的突变株HUI821和GUI089合成L-精氨酸的中心代谢网络。分别测定了它们在特定培养时段（5052h）L-精氨酸等代谢物的胞外浓度,由此计算这一时段这些代谢物在发酵液中积累（或消耗）的速率,分别作出这3株菌在拟稳态下的代谢流量分布图,进而研究育种过程中不同遗传标记的叠加对代谢网络中L-精氨酸合成流量分布的影响。结果表明遗传标记的引入使流量分配发生了重大变化,节点处的流量分配朝着有利于L-精氨酸合成的方向改变。从代谢流量分析角度上,证明结构类似物抗性和敏感性突变是代谢流导向和设计育种的有效手段,代谢流量分析将成为设计育种的提供新思路。对菌株GUI089进行了培养基和发酵条件的优化。得到最佳的种子培养基（g/L）:葡萄糖30,玉米浆25,硫酸铵25,KH2PO41,MgSO4·7H2O 0.5,碳酸钙20,pH7.0,同时确定装液量25mL/250mL;最佳发酵培养基（g/L）:葡萄糖99.11,（NH4）2SO4 37.63,玉米浆20.90,KH2PO4 1.5,MgSO4·7H2O 0.6,生物素80μg/L,CaCO3 25;摇瓶发酵最佳培养条件:培养基初始pH7.2,种龄为18h,接种量8%,装液量为15mL/250mL,往复式摇床30℃培养,摇床转速100次/min,发酵周期90h。优化后最终产酸可达21.70g/L。结合菌株GUI089发酵过程曲线,对发酵过程进行了补加一些营养源的研究,结果表明,采用恰当的方式补加葡萄糖、谷氨酸和氨水,L-精氨酸产酸都有不同程度的提高。在对谷氨酸棒杆菌GUI089代谢网络和发酵特性研究的基础上,通过添加适量的氨基酸、有机酸和维生素等对L-精氨酸发酵进行代谢调控。结果发现大部分添加物对L-精氨酸的积累都有一定的影响,特别是L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-天冬氨酸、L-缬氨酸、L-精氨酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、烟酸、维生素B6、叶酸和硫胺素等添加物对菌株GUI089合成L-精氨酸明显有促进作用,添加后最大产酸量比不添加任何物质提高10%左右。添加蛋白胨和牛肉膏等会导致产酸降低,而添加SDS、氯霉素、豆饼水解液和酵母膏等对产酸有一定的促进作用。在培养基中添加表面活性剂吐温80和稳定剂植酸钠均会抑制菌体生长并导致产酸下降。从代谢层面上分析,这些添加物除了促进菌体自身生长,同时防止了菌体对各添加物的过量合成,强化菌株GUI089合成L-精氨酸的代谢途径。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 L-精氨酸的理化性质
• 1.2 L-精氨酸的功能及应用
• 1.3 L-精氨酸的制备方法
• 1.4 生物制备L-精氨酸的研究进展
• 1.5 L-精氨酸代谢控制育种
• 1.5.1 L-精氨酸的合成代谢途径
• 1.5.2 L-精氨酸的调节机制
• 1.5.3 L-精氨酸产生菌育种技术难题和应对策略
• 1.6 本论文的研究内容
• 第二章 L-精氨酸菌种选育
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 出发菌株
• 2.2.2 实验仪器与试剂
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 培养方法
• 2.2.5 诱变方法
• 2.2.6 筛选方法
• 2.2.7 分析方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 出发菌株遗传标记的鉴定
• 2.3.2 菌体生长曲线的测定
• 2.3.3 诱变剂量和时间的确定
• 2.3.4 L-精氨酸菌种选育结果
• 2.4 本章小结
• 第三章 L-精氨酸生物合成的代谢流量分析
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 实验仪器
• 3.2.2 实验试剂
• 3.2.3 菌株
• 3.2.4 培养基
• 3.2.5 培养方法
• 3.2.6 分析方法
• 3.3 结果和讨论
• 3.3.1 L-精氨酸合成的化学计量式
• 3.3.2 L-精氨酸形成阶段各菌株的胞外代谢产物浓度的测定
• 3.3.3 L-精氨酸形成阶段各菌株的代谢流量分配的计算
• 3.3.4 出发菌株GWY020 与其突变株代谢流分析结果比较
• 3.4 本章小结
• 第四章 L-精氨酸发酵条件的优化
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验菌株
• 4.2.2 实验仪器与试剂
• 4.2.3 培养基和培养方法
• 4.2.4 分析方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 种子培养基及其培养条件的优化
• 4.3.2 发酵培养基及其培养条件的优化
• 4.3.3 L-精氨酸产生菌GUI089 的发酵过程曲线
• 4.3.4 分批补料发酵的初步研究
• 4.4 本章小结
• 第五章 添加各种物质对L-精氨酸发酵影响的初步研究
• 5.1 前言
• 5.2 实验材料与方法
• 5.2.1 实验菌株
• 5.2.2 实验仪器与试剂
• 5.2.3 培养基
• 5.2.4 培养方法
• 5.2.5 分析方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 L-精氨酸代谢网络分析
• 5.3.2 各种氨基酸对L-精氨酸发酵影响的初步研究
• 5.3.3 各种有机酸对L-精氨酸发酵影响的初步研究
• 5.3.4 各种维生素对 L-精氨酸发酵影响的初步研究
• 5.3.5 各种醇类对L-精氨酸发酵影响的初步研究
• 5.3.6 各种表面活性剂、稳定剂和消泡剂等对L-精氨酸发酵影响的初步研究
• 5.3.7 其它营养源对L-精氨酸发酵影响的初步研究
• 5.4 本章小结
• 第六章 结论与展望
• 6.1 主要结论
• 6.2 课题展望
• 致谢
• 参考文献
• 作者在攻读硕士学位期间发表的论文
• 附录：分析图谱