海参肠碱性磷酸酶的提取、纯化及其特性研究

论文摘要

碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase, ALP）是最重要的磷酸酶之一,广泛存在于微生物和动物界。ALP在生物体内直接参与磷酸酶基团的转移和代谢过程,对钙质吸收、骨骼形成磷酸钙沉淀都起着重要的作用。提纯的碱性磷酸酶常用于核酸的研究,是基因工程常用的工具酶,也是酶标免疫测定的常用工具酶之一。本文以酶活力比较高的海参肠为原料,从中分离纯化碱性磷酸酶,并对其理化性质进行研究。经过Tris-HCl缓冲液（pH 8.9）抽提、正丁醇处理、70%硫酸铵沉淀分离、超滤脱盐除去部分杂蛋白及盐离子、DEAE-52离子柱、Sephacryl S-200凝胶柱和Native-PAGE对样品进行分离纯化获得碱性磷酸酶,纯化后的酶经SDS-PAGE测定得到两条带,分子量约为97.2 kDa和34.7 kDa。该酶纯化倍数为20.55,比活力达到58.6 U/mg。以4-硝基苯磷酸二钠盐（p-NPP）为底物,测得该酶最适pH为10.5,最适温度为40℃,在20-30℃时有很高的稳定性。金属离子对该酶的作用效果不同,Mg2’对碱性磷酸酶有激活作用,Zn2+、Ba2+、 Sn2’和Ca2’对该酶均有不同程度的抑制作用,其中Zn2+的抑制作用最强。EDTA、 L-Phe、Na2WO4、Na2HPO4和左旋咪唑对海参肠ALP的酶活均有影响,其中EDTA和Na2WO4对ALP活力影响最大。HPO42-是碱性磷酸酶催化p-NPP的产物之一、W042-是产物类似物,30mmol/L HPO42-使酶活仅剩43.7%,而30 mmol/L WO42-使酶活仅剩41.8%。海参肠碱性磷酸酶催化p-NPP水解反应,反应的米氏常数（Km）和最大速度常数（Vm）分别为KKm=5.76 mmol/L、Vm=24.45 μmol/L·min。分别采用chloramines-T、 PMSF、 IAc、 DTT等化学修饰剂选择修饰海参肠碱性磷酸酶的多种氨基酸残基,并测定其酶活力变化。结果表明,Met、His不是碱性磷酸酶的必需功能基团,Ser可能是碱性磷酸酶的必需功能基团,二硫键对保护碱性磷酸酶的催化功能可能是必需的。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 海参
• 1.1.1 国内外海参的自然分布
• 1.1.2 海参的化学组成
• 1.1.3 海参的营养与功效
• 1.2 碱性磷酸酶的研究进展
• 1.2.1 概述
• 1.2.2 碱性磷酸酶的检测方法
• 1.2.2.1 分光光度法
• 1.2.2.2 荧光法
• 1.2.2.3 双酶级联法
• 1.2.3 碱性磷酸酶的功能
• 1.2.4 碱性磷酸酶的分离纯化
• 1.2.5 碱性磷酸酶的理化特性
• 1.2.6 碱性磷酸酶的功能基团
• 1.2.7 碱性磷酸酶在水产动物应激过程中的变化及作用
• 1.3 立题背景和意义
• 1.4 本论文研究的主要内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 主要实验仪器
• 2.1.3 主要实验试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 主要试剂配制
• 2.2.1.1 Tris-Hcl缓冲溶液的配制
• 2.2.1.2 甘氨酸缓冲溶液的配制
• 2.2.1.3 p-NPP底物溶液的配制
• 2.2.2 对硝基苯酚标准曲线的绘制
• 2.2.3 考马斯亮蓝染色法（Bradford法）绘制蛋白质标准曲线
• 2.2.4 原料预处理
• 2.2.5 粗酶液的提取
• 2.2.6 碱性磷酸酶活力测定
• 2.2.7 蛋白质含量的测定
• 2.2.7.1 考马斯亮蓝染色法（Bradford法）
• 2.2.7.2 紫外分光光度法测定蛋白质含量
• 2.2.8 碱性磷酸酶的分离纯化
• 2.2.8.1 DEAE-52离子柱层析
• 2.2.8.2 Sephacryl S-200柱层析
• 2.2.8.3 TSK-GEL 3000分子排阻色谱柱
• 2.2.8.4 Native-PAGE分离
• 2.2.9 电泳方法
• 2.2.9.1 蛋白质凝胶电泳试剂的配制
• 2.2.9.2 Native-PAGE电泳
• 2.2.9.3 SDS-PAGE电泳
• 2.2.10 碱性磷酸酶特性分析
• 2.2.10.1 最适pH的测定
• 2.2.10.2 最适温度及稳定性的测定
• 2.2.10.3 金属离子对碱性磷酸酶活力的影响
• 2.2.10.4 抑制剂对碱性磷酸酶活力的影响
• m及V_m'>2.2.10.5 米氏常数K_m及V_m
• 2.2.11 碱性磷酸酶功能基团分析
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 海参肠碱性磷酸酶粗酶的特性
• 3.1.1 海参肠ALP的最适pH及其pH稳定性
• 3.1.2 海参肠ALP的最适温度及其温度稳定性
• 3.1.3 金属离子对海参肠ALP的影响
• 3.1.4 抑制剂对海参肠ALP的影响
• 3.2 海参肠碱性磷酸酶的分离纯化
• 3.2.1 DEAE-52阴离子交换层析
• 3.2.2 Sephacryl S-200凝胶层析
• 3.2.3 TSK GEL-3000凝胶层析
• 3.2.4 Native-PAGE分离
• 3.2.5 纯化结果分析
• 3.3 纯化后海参肠碱性磷酸酶的特性
• 3.3.1 碱性磷酸酶的最适pH
• 3.3.2 酶的最适温度和热稳定性
• 3.3.3 金属离子对酶活性的影响
• 3.3.4 抑制剂对海参肠ALP活力的影响
• m及V_m'>3.3.5 米氏常数K_m及V_m
• 3.4 海参肠碱性磷酸酶的功能基团
• 3.4.1 氯胺-T对碱性磷酸酶活力的影响
• 3.4.2 PMSF对碱性磷酸酶活力的影响
• 3.4.3 IAc对碱性磷酸酶活力的影响
• 3.4.4 DTT对碱性磷酸酶活力的影响
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录