无融合生殖植物龙须草PcG类基因EbEZ的克隆与功能分析

论文摘要

多梳（Polycomb Group, PcG）蛋白是植物和动物在进化过程中形成的一类保守的转录抑制因子,它以蛋白复合体的形式发挥作用。在拟南芥中已确定的多梳蛋白抑制复合物2（PRC2）包含四种核心蛋白：E（z）、Su（z）12、ESC （Extra sex combs）和P55,它们所形成的FIS复合物主要起抑制中央细胞不受精即启动胚乳发育的作用。龙须草（Eulaliopsis binata）为禾本科无融合生殖植物,其胚乳不经过受精、由中央细胞自主分裂形成。本研究以无融合生殖植物龙须草为材料,克隆其PcG复合物的EbEZ同源基因,比较其核苷酸、氨基酸序列的差异,分析EbEZ基因在龙须草生长发育中的表达模式,考察DNA甲基化对基因表达的影响,并通过转基因异源表达验证其功能,为最终阐明龙须草无融合生殖中胚乳自主发生的分子机制奠定基础。主要结果如下：（1） EbEZ基因的克隆与序列分析：通过同源克隆结合RACE方法,从龙须草基因组中分离得到两个E（z）基因EbEZ1和EbEZ2。通过Southern blotting实验证实龙须草基因组中存在2个拷贝的E（z）基因。其中EbEZ1的cDNA全长3300 bp, DNA全长9600 bp,包含16个外显子,15个内含子；而EbEZ2的cDNA全长3130 bp,DNA全长9500 bp,也含有16个外显子和15个内含子。利用NCBI蛋白结构在线网站分析EbEZ蛋白结构域,结果显示在EbEZ1和EbEZ2蛋白中均存在5类典型的保守结构域,分别是EZD1、EZD2、SANT、CXC和SET结构域。系统进化分析显示,EbEZ1与玉米的ZmMEZ1序列相似性最高；而EbEZ2则与ZmMEZ3相似性最高。（2） EbEZ基因启动子分离与顺式作用元件分析：采用染色体步移（Genome Walking）技术分别克隆得到EbEZ1和EbEZ2基因的启动子,分析发现在EbEZ1和EbEZ2启动子序列中存在对环境改变敏感的应答元件；除此之外,还包含一些在胚乳、花粉或种子中具有组织特异性表达的元件序列。（3） EbEZ基因在龙须草中的表达分析：利用Real-time PCR技术分析E（z）基因在龙须草中的时空表达模式,发现EbEZ1和EbEZ2在龙须草根、茎、叶、花和种子中都有不同程度的表达,但在花序与种子中的表达量高于营养器官；RT-PCR结果显不,EbEZ1在开花前的子房和发育早、中期种子中的表达量显著低于成熟阶段的种子。（4） EbEZ基因启动子甲基化分析：利用EMBOSS CpG岛在线分析程序,得出在EbEZ1启动子区存在2个CpG岛,而在EbEZ2启动子区只存在一个CpG岛。进一步采用亚硫氢酸盐测序法分析EbEZ1启动子区的甲基化状态,结果显示其甲基化程度在开花前的子房中最高,在种子发育早、中期也保持较高的甲基化状态,但在成熟种子中甲基化程度显著降低,与EbEZ1在这些发育阶段的表达相一致。（5） EbEZ1基因的异源表达分析：将龙须草EbEZ1基因转化模式植物拟南芥及水稻,在转基因拟南芥中叶及生长点的发育被抑制,在转基因水稻中小花数量、小花的颖壳数目和花粉育性较野生型有改变。对转基因植株的表型分析表明,龙须草EbEZ1基因可能参与植物营养生长和生殖生长的调控。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 植物无融合生殖研究概述
• 1.1.1 无融合生殖的概念
• 1.1.2 无融合生殖的类型
• 1.1.3 无融合生殖的机制与研究意义
• 1.1.4 龙须草无融合生殖研究概况
• 1.2 PcG基因研究概述
• 1.2.1 PcG基因的发现
• 1.2.2 PcG蛋白的组成
• 1.2.3 PcG介导的转录抑制机制
• 1.2.4 植物中的PcG蛋白
• 1.2.5 PcG蛋白与无融合生殖
• 1.3 植物中E（z）基因研究概述
• 1.3.1 E（z）基因的结构与功能
• 1.3.2 E（z）基因的作用机制
• 1.3.3 E（z）类基因的印迹与调控机制
• 1.4 本研究的目的与意义
• 2 实验材料
• 2.1 植物材料
• 2.2 质粒与菌株
• 3 实验方法
• 3.1 龙须草EbEZ基因及其启动子的克隆
• 3.1.1 RACE克隆EbEZ基因cDNA
• 3.1.1.1 RNA的提取与纯化
• 3.1.1.2 反转录合成第一链cDNA
• 3.1.1.3 简并PCR扩增才cDNA片段
• 3.1.1.4 RACE克隆cDNA末端
• 3.1.1.5 cDNA全长的获得
• 3.1.1.6 DNA全长的获得
• 3.1.2 Southern杂交分析
• 3.1.2.1 DNA的提取与纯化
• 3.1.2.2 DNA酶切与电泳
• 3.1.2.3 转膜与固定
• 3.1.2.4 分子杂交
• 3.1.2.5 洗膜及免疫检测
• 3.1.3 Genome Walking克隆EbEZ启动子
• 3.1.3.1 DNA的提取与纯化
• 3.1.3.2 染色体步移文库的构建
• 3.1.3.3 启动子的PCR扩增
• 3.1.4 PCR扩增产物的回收
• 3.1.5 TA克隆
• 2法制备大肠杆菌感受态细胞'>3.1.6 CaCl₂法制备大肠杆菌感受态细胞
• 3.1.7 化学转化法转化大肠杆菌感受态细胞
• 3.1.8 阳性克隆的鉴定与测序
• 3.1.9 EbEZ基因生物信息学分析
• 3.1.9.1 基因结构蛋白性质分析
• 3.1.9.2 系统进化分析
• 3.1.9.3 启动子顺式作用元件分析
• 3.1.9.4 启动子CpG岛分析
• 3.2 龙须草EbEZ基因表达模式分析
• 3.2.1 RNA提取及质量检测
• 3.2.2 Real-time PCR分析
• 3.3 龙须草EbEZ1基因启动子甲基化分析
• 3.3.1 基因组DNA的提取
• 3.3.2 亚硫氢酸盐修饰基因组DNA
• 3.3.3 亚硫氢酸盐PCR（Bisulfite Sequencing PCR,BSP）
• 3.3.4 序列甲基化分析
• 3.4 龙须草EbEZ1转基因分析
• 3.4.1 植物表达载体的构建
• 3.4.1.1 目的片段的PCR扩增
• 3.4.1.2 碱裂解法提取质粒
• 3.4.1.3 质粒的双酶切
• 3.4.1.4 重组质粒的获得
• 3.4.2 重组农杆菌工程菌株的获得
• 3.4.2.1 农杆菌感受态细胞的制备
• 3.4.2.2 重组质粒转化农杆菌感受态细胞
• 3.4.2.3 阳性克隆的鉴定
• 3.4.3 拟南芥的转化
• 3.4.3.1 拟南芥的种植
• 3.4.3.2 拟南芥的转化
• 3.4.3.3 转基因拟南芥的筛选
• 3.4.4 水稻的转化
• 3.4.4.1 愈伤的诱导与继代
• 3.4.4.2 农杆菌介导的遗传转化
• 3.4.4.3 植株再生与移栽
• 4 结果与分析
• 4.1 龙须草EbEZ基因及启动子的克隆
• 4.1.1 RACE克隆EbEZ基因
• 4.1.1.1 简并PCR扩增获得EbEZ基因EST序列
• 4.1.1.2 EbEZ基因5'-RACE及3'-RACE扩增
• 4.1.1.3 EbEZ基因cDNA及DNA的扩增
• 4.1.1.4 Southern杂交分析
• 4.1.2 EbEZ基因生物信息学分析
• 4.1.2.1 EbEZ基因cDNA序列及结构分析
• 4.1.2.2 EbEZ基因DNA序列及结构分析
• 4.1.2.3 EbEZ蛋白结构域分析
• 4.1.2.4 EbEZ基因进化分析
• 4.1.3 Genome Walking克隆EbEZ启动子
• 4.1.3.1 构建染色体步移文库
• 4.1.3.2 染色体步移扩增启动子
• 4.1.3.3 启动子的生物信息学分析
• 4.2 龙须草EbEZ基因表达模式分析
• 4.2.1 RNA提取及反转录
• 4.2.2 Real-time PCR结果与分析
• 4.3 龙须草EbEZ1启动子甲基化分析
• 4.3.1 CpG岛预测
• 4.3.2 亚硫氢酸盐法分析CpG岛区的甲基化状态
• 4.3.3 EbEZ1启动子CpG岛区甲基化分布
• 4.4 龙须草EbEZ1转基因分析
• 4.4.1 龙须草EbEZ1表达载体的构建
• 4.4.2 龙须草EbEZ1转化拟南芥分析
• 4.4.3 龙须草EbEZ1转化水稻分析
• 5 讨论
• 5.1 龙须草EbEZ基因的克隆及进化分析
• 5.2 龙须草EbEZ基因的表达
• 5.3 龙须草EbEZ启动子分析
• 5.4 龙须草EbEZ1甲基化分析
• 5.5 龙须草EbEZ1功能分析
• 参考文献
• 附录一 实验中用到的引物
• 附录二 常用培养基及溶液配制
• 附录三 常用实验方法
• 致谢