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海岛棉ERF族B3和B1亚组转录因子基因的克隆与特征研究

2020-12-11阅读(585)

海岛棉ERF族B3和B1亚组转录因子基因的克隆与特征研究

论文摘要

棉花是重要的经济作物,各种病害特别是黄萎病严重影响着棉花生产,基因工程技术的发展为棉花抗病育种提供了新途径。ERF族转录因子通过ERF域和GCC-box等顺式元件相互作用,调控下游基因如病程相关蛋白基因的转录过程,从而改变植物抗病、抗逆性状,在植物抵抗生物和非生物胁迫中扮演重要角色。ERF族转录因子分为不同组类,其中B3亚组成员通过上调启动子中含有GCC-box元件基因的转录活性,增强植物体抗病性,而B1亚组转录因子对启动子中含有GCC-box基因的转录活性起抑制作用,具有防止下游基因过度激活的功能。克隆这两亚组基因、探究其生物学功能,对农作物抗病性状的遗传改良具有重要意义。为了克隆与棉花黄萎病抗性相关的B3/B1亚组转录因子基因,本研究首先利用陆地棉EST库进行电子克隆,获得20个B3亚组和9个B1亚组陆地棉ERF族基因。然后根据海岛棉和陆地棉的同源性及ERF族转录因子的保守性,以黄萎病处理的海岛棉幼苗cDNA为模板,利用PCR技术扩增出29个具有完整阅读框的同源基因,其中27个是第一次从海岛棉分离出的新基因。利用实时荧光定量技术,对大丽轮枝菌孢子液处理的海岛棉幼苗根组织中各基因转录本量分析发现:GbB3002、GbB3003、GbB3009、GbB3016-20、GbB1006、GbB1007等多个基因明显增加,上调幅度在7倍以上;GbB3012和GbB3015两个基因只有处理前的三分之一左右;GbB3010基本没有变化;其它基因虽有上升,但上调幅度较小,都在5倍以下。利用RACE技术扩增基因的5’-和3’-UTR,获得4个基因全长cDNA序列,分别命名为GbEREB3（GbB1007）、GbEREB4 （GbB1006）、GbEREB5 （GbB3009）和GbEREB6 （GbB3015）,并提交到NCBI GenBank数据库,注册号分别是JN003806,JN003807,JN003808,JN003809。在利用生物信息学对4个基因分析的基础上,构建GFP瞬时表达载体转化洋葱表皮细胞进行亚细胞定位分析,结果表明四个转录因子均分布于核内;利用BL21（DE3）原核表达菌株,表达GST和转录因子融合蛋白,纯化后进行凝胶阻滞实验,证明它们和GCC-box能够特异结合;构建超表达载体转化烟草,对T0代植株进行半定量和荧光定量分析发现, GbEREB3/4和GbEREB5/6在转基因阳性植株中均得到异位表达,而防卫基因NtCHI-B和NtPR2的转录本量相应地减少和增加,该结果表明GbEREB3/4和GbEREB5/6分别具有下调和上调NtCHI-B和NtPR2基因转录活性的功能,暗示这些基因参与防卫反应过程。另外,构建超表达载体将B1亚组（Gb）EREB2（GbB1004）基因转入陆地棉,实时荧光定量分析表明T0阳性棉株中几丁质酶（CHI）和β-1,3-葡聚糖苷酶（BGL）基因的转录活性下降;测量GbEREB2转基因阳性棉株的离体叶片失水率发现比受体叶片更容易失水,表明GbEREB2基因不仅参与棉花的防卫反应过程,而且与植物的水分代谢生理过程密切相关。研究表明这些基因参与棉花对黄萎病菌防卫反应的应答过程,可能参与棉花对黄萎病抗性的调控。有关转基因阳性株系对黄萎病菌抗性水平的鉴定分析研究,正在进行之中。本研究为抗黄萎病相关基因的筛选奠定了基础。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 引言
  • 1.1 棉花黄萎病及其基因工程育种研究
  • 1.1.1 棉花黄萎病害及其影响
  • 1.1.2 棉花黄萎病病原体及其类型
  • 1.1.3 棉花黄萎病致病机理
  • 1.1.4 棉花黄萎病抗性类型
  • 1.1.5 植物诱导抗性的形成机制
  • 1.1.6 棉花黄萎病抗性的遗传分析
  • 1.1.7 棉花抗黄萎病基因工程育种工作取得成绩和存在问题
  • 1.2 ERF 族转录因子研究进展
  • 1.2.1 转录因子的结构和功能
  • 1.2.2 乙烯合成和乙烯信号传导途径
  • 1.2.3 ERF 族转录因子分类研究
  • 1.2.4 ERF 族转录因子结构和功能研究
  • 1.3 研究目的意义和实验内容
  • 1.3.1 研究目的意义
  • 1.3.2 研究内容
  • 第二章 海岛棉ERF 族B3 和B1 亚组基因编码区的克隆
  • 2.1 实验材料
  • 2.2 方法步骤
  • 2.2.1 陆地棉B3 和B1 亚组基因cDNA 序列的获得
  • 2.2.2 同源扩增引物的设计合成
  • 2.2.3 黄萎病菌处理材料的获得
  • 2.2.4 总RNA 提取和质量检测
  • 2.2.5 棉花总RNA 的反转录
  • 2.2.6 PCR 扩增
  • 2.2.7 回收目的片段
  • 2.2.8 PCR 产物克隆测序
  • 2.3 结果分析
  • 2.3.1 陆地棉B3 和B1 亚组ERF 族转录因子基因的电子克隆
  • 2.3.2 RNA 提取质量的检测
  • 2.3.3 PCR 扩增电泳检测
  • 2.3.4 PCR 产物的克隆测序
  • 2.3.5 海岛棉B3 和B1 亚组基因编码区序列
  • 2.4 讨论小结
  • 第三章 B3 和B1 亚组基因黄萎病诱导表达的荧光定量分析
  • 3.1 实验材料
  • 3.2 方法步骤
  • 3.2.1 材料培育和RNA 的提取
  • 3.2.2 cDNA 的获得
  • 3.2.3 实时荧光定量PCR 引物设计合成
  • 3.2.4 实时荧光定量PCR
  • 3.3 结果分析
  • 3.3.1 RNA 提取质量分析
  • 3.3.2 实时荧光定量PCR 分析
  • 3.4 讨论小结
  • 第四章 GbEREB3/4/5/6 基因全长 cDNA 序列的获得
  • 4.1 实验材料
  • 4.1.1 植物材料和黄萎病菌株
  • 4.1.2 感受态菌株及克隆载体
  • 4.1.3 生化及分子生物学试剂
  • 4.1.4 试剂盒
  • 4.1.5 引物合成和测序
  • 4.2 方法步骤
  • 4.2.1 样品准备和总RNA 的提取
  • 4.2.2 5’-RACE 扩增
  • 4.2.3 3’-RACE 扩增
  • 4.3 结果与分析
  • 4.3.1 RNA 提取
  • 4.3.2 5’-RACE 扩增基因5’端
  • 4.3.3 3’-RACE 扩增基因3’端
  • 4.3.4 克隆测序
  • 4.4 讨论小结
  • 第五章 GbEREB3/4/5/6 的生物信息学分析
  • 5.1 实验材料
  • 5.2 方法步骤
  • 5.2.1 蛋白质氨基酸序列预测
  • 5.2.2 海岛棉和陆地棉同源序列比对
  • 5.2.3 预期蛋白的理化性质及其氨基组成分析
  • 5.2.4 ERF 保守域同源比对和立体结构分析
  • 5.2.5 核定位可能性分析
  • 5.2.6 系统发育树构建
  • 5.3 结果分析
  • 5.3.1 GbEREB3/4/5/6 阅读框分析
  • 5.3.2 海陆同源基因核苷酸和预期蛋白氨基酸序列一致性
  • 5.3.3 预期蛋白的理化性质和氨基酸组成
  • 5.3.4 ERF 域同源比对和立体结构预测
  • 5.3.5 与拟南芥ERF 族转录因子同源比对和系统发育树构建
  • 5.3.6 亚细胞定位分析
  • 5.4 讨论小结
  • 第六章 GbEREB3/4/5/6 亚细胞定位分析
  • 6.1 实验材料
  • 6.2 方法步骤
  • 6.2.1 GFP 融合蛋白瞬时表达载体的构建
  • 6.2.2 基因枪转化
  • 6.3 结果分析
  • 6.4 讨论小结
  • 第七章 GbEREB3/4/5/6 和 GCC-box 结合特性分析
  • 7.1 实验材料
  • 7.1.1 菌株、载体、引物
  • 7.1.2 试剂及其配制
  • 7.1.3 主要仪器和用具
  • 7.2 方法步骤
  • 7.2.1 原核表达目的片段引物
  • 7.2.2 PCR 扩增、电泳检测和胶回收
  • 7.2.3 目的片段的可隆测序
  • 7.2.4 GST 融合蛋白原核表达载体的构建和表达菌株的克隆
  • 7.2.5 诱导表达和样品收集
  • 7.2.6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
  • 7.2.7 融合蛋白的纯化
  • 7.2.8 凝胶阻滞实验（EMSA）
  • 7.3 结果分析
  • 7.3.1 原核表达载体的构建
  • 7.3.2 载体原核表达载体表达分析
  • 7.3.3 载体原核表达融合蛋白的纯化
  • 7.3.4 基因探针标记效率检测
  • 7.3.5 凝胶阻滞实验结果分析
  • 7.4 讨论小结
  • 第八章 GbEREB3/4/5/6 转化烟草及其功能分析
  • 8.1 实验材料
  • 8.2 方法步骤
  • 8.2.1 超表达载体构建
  • 8.2.2 农杆菌LBA4404 感受态细胞的制备
  • 8.2.3 农杆菌转化
  • 8.2.4 转化烟草
  • 8.2.5 植株基因组DNA 的小量提取
  • 8.2.6 转基因烟草阳性植株的PCR 鉴定
  • 8.2.7 烟草RNA 的提取
  • 8.2.8 RNA 反转录
  • 8.2.9 目的基因转录水平的半定量检测
  • 8.2.10 阳性植株防卫基因转录活性的RT-qPCR 检测
  • 8.3 结果分析
  • 8.3.1 转基因阳性植株的鉴定
  • 8.3.2 转基因株系内目的基因的转录活性分析
  • 8.3.3 目的及下游基因转录水平分析
  • 8.4 讨论小结
  • 第九章（Gb）EREB2 转基因陆地棉阳性株系的获得和功能分析
  • 9.1 实验材料
  • 9.1.1 棉花转基因材料
  • 9.1.2 菌株与表达载体
  • 9.1.3 试剂药品
  • 9.1.4 主要仪器
  • 9.1.5 引物合成和测序
  • 9.1.6 其它用品
  • 9.2 方法步骤
  • 9.2.1 载体构建
  • 9.2.2 农杆菌介导转化棉花
  • 9.2.3 基因枪轰击法转化棉花
  • 9.2.4 花粉管通道法转化棉花
  • 9.2.5 转基因阳性植株的抗性筛选
  • 9.2.6 转基因阳性植株的PCR 鉴定
  • 9.2.7 Southern blot 鉴定
  • 9.2.8 防卫反应基因转录水平分析
  • 9.2.9 生理水平分析-叶片失水率测验
  • 9.3 结果分析
  • 9.3.1 转基因阳性棉株鉴定
  • 9.3.2 阳性棉株几丁质酶和β-1,3-葡糖苷酶转录水平
  • 9.3.3 阳性棉株离体叶片失水率
  • 9.4 讨论小结
  • 第十章 结论
  • 10.1 研究进展
  • 10.2 创新点
  • 10.3 展望
  • 参考文献
  • 附录
  • 致谢
  • 作者简历

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