花生四烯酸发酵工艺研究

论文摘要

花生四烯酸（ArachidonicAcid,简称AA,即5,8,11,14.二十碳四烯酸）属于ω-6系列长链多不饱和脂肪酸,是人体前列腺素、凝血噁烷、环前列腺素、白三烯合成的重要前体物质,具有多种生理活性。AA被广泛应用于医药、化妆品、食品、农业及其他领域。目前,高山被孢霉发酵法被公认为AA最好的工业化生产方法。但至今此生产方法发酵过程AA含量难以控制,饱和、单不饱和脂肪酸含量过高以及葡萄糖转化率低等关键问题没有得到解决。本文引入代谢工程的方法研究Mortierella alpina ME-1体内AA合成过程,采用多种策略提高AA单产水平。1.应用响应曲面法优化花生四烯酸发酵培养基通过响应曲面优化法优化了Mortierella alpina ME-1发酵生产生物质及AA的培养基组成。生成了2个经验多项式模型。根据模型优化,最优的生物质发酵培养基组成为:葡萄糖90.16g/L,酵母膏12.50g/L,KH2PO43.80g/L,NaNO33.54 g/L。生物质单产水平预测为36.86 g/L。最优的AA发酵培养基为:葡萄糖103.16g/L,酵母膏11.66g/L,KU2PO43.80g/L,NaNO3 3.43 g/L。该培养基下,AA单产水平预测为9.65 g/L。验证试验表明这两个模型较好的解释了生物质及AA的生成,预测值与实际值十分接近。同时发酵罐试验表明优化后的培养基同样提升了罐上的发酵水平:最大生物量34.21±1.01 g/L;最大AA单产水平9.86±0.45 g/L。2.花生四烯酸合成过程的代谢通量分析与调控代谢通量分布分析已经成为研究发酵过程特性的有效方法。今建立了花生四烯酸在高山被孢霉ME-1（Mortierella alpina ME-1）体内合成的代谢通量模型,求解不同氮源浓度下发酵各时期的碳流分布。充足氮源发酵时,指数生长期、减速期、稳定期流向AA的碳流分别占总碳流的3.28%,8.80%和6.97%。而通过限制性氮源发酵并在96 h补加0.05%的NaN03成功地引导了发酵碳流迁移,将各时期流向AA的碳流分别提高至3.95%,19.21%和39.29%,并最终实现AA单产水平从1.3 g/L提高到3.5 g/L。这些结果表明限制性氮源发酵并在稳定期补加低浓度的氮源能显著提高AA单产水平。3.基于动力学模型的动态代谢通量分析模型分析高山被孢霉发酵生产花生四烯酸动力学特征,建立了氮源与葡萄糖双底物限制动力学模型,在此基础上结合代谢流分析理论提出了花生四烯酸发酵动态代谢通量分析模型,通过非线性最小二乘优化拟合获得参数。进一步试验表明这个模型具有较高的精确度,能很好模拟发酵过程,并能很容易地获得不同发酵时间的代谢流分布。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 前言
• 2 花生四烯酸简介
• 2.1 长链多不饱和脂肪酸
• 2.2 花生四烯酸
• 3 花生四烯酸在人体内生理代谢途径及功能
• 3.1 花生四烯酸在人体内的合成代谢
• 3.2 花生四烯酸在人体内的释放途径
• 3.3 花生四烯酸的生理功能
• 4 花生四烯酸的应用
• 5 花生四烯酸的市场前景
• 5.1 花生四烯酸在奶制品行业中的市场
• 5.2 花生四烯酸在保健品市场的潜力
• 6 花生四烯酸油脂的制备
• 6.1 微生物油脂的历史回顾
• 6.2 微生物发酵法生产 AA
• 6.2.1 微生物体内AA合成代谢网络
• 6.2.2 高山被孢霉发酵法生产花生四烯酸工艺研究
• 6.2.3 发酵法生产 AA国内外研究进展及存在的问题
• 6.2.4 代谢工程
• 7 本论文研究的主要内容
• 参考文献
• 第二章 应用响应曲面法优化花生四烯酸发酵培养基
• 1 前言
• 2 试验材料与方法
• 2.1 菌种
• 2.2 试验试剂
• 2.3 试验仪器
• 2.4 培养基的制备
• 2.5 摇瓶发酵工艺
• 2.6 发酵罐发酵工艺
• 2.7 分析方法
• 2.8 试验的设计及数据分析
• 3 结果
• 3.1 培养基成分对发酵影响模型的确定
• 3.2 以最大化生物量为目标优化培养基组成
• 3.3 以最大化 AA单产水平为目标优化培养基组成
• 3.4 模型的验证
• 3.5 5L发酵罐试验验证结果
• 4 讨论
• 5 本章小结
• 参考文献
• 第三章 花生四烯酸合成过程的代谢通量分析与调控
• 1 前言
• 2 试验材料与方法
• 2.1 菌种
• 2.2 试验试剂
• 2.3 试验仪器
• 2.4 培养基的制备
• 2.5 发酵工艺
• 2.6 分析方法
• 2.7 AA发酵代谢机理分析及代谢通量模型的建立
• 2.7.1 代谢机理分析
• 2.7.2 代谢通量分析模型的建立
• 3 结果与讨论
• 3.1 充足氮源发酵碳流分布探讨
• 3.2 限制氮源浓度引导发酵碳流迁移的探讨
• 3.3 AA发酵总碳流的分布分析
• 4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 基于动力学模型的动态代谢通量分析模型
• 1 前言
• 1.1 微生物发酵过程中常用数学模型
• 1.1.1 菌体生长动力学模型
• 1.1.2 代谢产物生成动力学模型
• 1.1.3 基质消耗动力学模型
• 1.2 模型的求解
• 1.2.1 模型参数的确定
• 1.2.2 模型的求解
• 2 试验材料与方法
• 2.1 菌种
• 2.2 试验试剂
• 2.3 试验仪器
• 2.4 培养基的制备
• 2.5 发酵工艺
• 2.6 分析方法
• 2.7 双底物限制动力学模型的构建
• 2.7.1 氮源受限制菌体生长及氮源消耗动力学模型的构建
• 2.7.2 碳源消耗动力学模型及受碳源限制的油脂生成模型
• 2.7.3 基于动力学模型的动态代谢通量分析模型的构建
• 2.7.4 基于动力学模型的动态代谢通量分析模型的构建
• 3 结果与讨论
• 3.1 模型参数的求取
• 3.2 模型的验证
• 3.3 AA合成代谢流量分布探讨
• 4 本章小结
• 参考文献
• 第五章 结论与展望
• 1 结论
• 2 展望
• 致谢
• 作者简介