论文摘要
近年来,蓝藻水华日趋频繁,产生了大量对人类健康有极大危害的微囊藻毒素（Microcystins, MCs）。研究表明MCs主要产生肝毒性,长期慢性暴露甚至可以导致肝癌。早期研究主要集中在MCs的毒效应及其损伤机制等方面,而对人群尤其是儿童的健康效应研究不多。目前国内外尚无MCs所致肝损伤的易感性生物标志物研究,因此筛选和保护对MCs所致肝损伤有易感性的人群具有重要的现实意义。MCs是由淡水藻类铜绿微囊藻产生的一类具有生物活性的环状七肽,目前已发现80余种亚型,其中MC-LR毒性最大,研究最多。谷胱甘肽巯基转移酶（Glutathione- S-transferase, GSTs）是一组具有解毒功能的蛋白超基因家族,是体内对外来物进行生物转化最重要的Ⅱ相代谢酶之一,是细胞抗损伤、抗癌变的主要解毒酶。MCs通过饮水途径进入人体内后,由肝细胞内GSTs进行解毒后,与体内的谷胱甘肽（Glutathione, GSH）共轭结合,然后转至肾脏和大肠排出体外。根据底物特性、DNA序列同源性、免疫学性质等,人类不同GSTs被分为GSTA1（Alpha-1）、GSTM1（Mu-1）、GSTP1（Pi-1）和GSTT1（Theta-1）等。其中GSTM1、GSTT1是最重要的两种,分别位于1p13.3,22q11.23,均存在缺失基因型,表现为基因部分和全部缺失。这两种基因缺失型个体产生GSTs的数量和活性大小存在差异,导致个体对MCs具有不同的解毒能力。本研究第一部分采用现况调查方法,以重庆市涪陵区儿童为研究对象,通过检测其MCs内外暴露水平和人群问卷调查,筛选出MCs暴露致肝损伤的人群,以探讨MCs暴露与肝损伤的关系。第二部分采用病例-对照研究方法,在MCs暴露人群中筛选出因MCs致肝损伤的人群和肝功能正常的人群,分别检测两组人群外周血细胞GSTM1和GSTT1基因型表达频率,寻找人群对MCs致肝损伤的易感性生物标志物。研究内容:一、儿童MCs内外暴露与肝损伤的关联性研究1.现况调查本研究以重庆市涪陵区为研究现场,采用整群抽样的方式,随机选取涪陵区5所中小学共1441名儿童为研究对象,通过问卷调查方法收集人群年龄、饮用水来源、饮水量和既往病史等一般特征信息。2.三种饮用水来源当地儿童饮用水有三种,一是井水,井水中未曾检测出MCs;二是湖一水,该湖虽然存在MCs污染,但均在国标饮用水MCs限值1μg （MC-LReq）/L以内;三是饮用湖二水,该湖MCs污染比较严重,2008年水中MCs高达4.3μg （MC-LReq）/L,是国标饮用水MCs限值的4倍。因此,我们推测该地区存在MCs暴露不同程度的人群,是开展水环境中MCs暴露及人群健康损害评价的较好现场。根据问卷调查的结果,将整个人群分为MCs高、低暴露组以及对照组三组。3. MCs内外暴露水平检测2005-2009年,每年10月采集涪陵区两湖及井水水样,并于2009年10月捕获两湖中的6种水产品（5种鱼类和1种鸭类）,同时抽取每名儿童3ml静脉血。上述水样、水产品以及血样经过萃取和纯化等前期处理后,采用酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）检测以上样本中MC-LR浓度。4.肝功酶检测2009年10月抽取每名儿童3ml静脉血,运用全自动生化分析仪检测血清中谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase, AST）、谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase, ALT）、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase, ALP）和谷氨酰转肽酶（γ-glutamyltransferase, GGT）。5.乙肝病毒检测同时抽取每名儿童3ml静脉血,采用ELISA试剂盒检测血清中HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb。二、GSTs基因多态性与MCs致肝损伤易感性的病例对照研究1.病例对照人群筛选根据问卷调查和肝功能酶学检测结果,在MCs暴露人群中排除乙肝感染、服用肝毒性药物等其他因素影响后,选择81名肝功酶异常的人群为病例组,同时随机选取92名肝功酶正常的人群作为对照组,进行病例对照研究。2. DNA提取及基因型检测2009年10月抽取每名儿童3ml静脉血,采用血液基因组提取试剂盒提取DNA,以β-Globin为内对照与GSTT1、GSTM1同时扩增进行多重PCR检测。三、数据统计方法采用SPSS 14.0软件包进行数据统计分析,在现况调查中根据数据分布特点,分别采用一般频数描述、χ2检验、Kruskal-Wallis检验和多因素方差分析等方法进行统计分析。在病例对照研究中采用χ2检验比较两组基因型的分布特点,人群特点采用t检验和χ2检验进行比较,P<0.05为具有统计学差异。研究结果:一、儿童MCs内外暴露与肝损伤的关联性研究1.人群流行病学特征在招募的1441儿童中,拒绝参加该研究的有24名儿童（1.7 %）,未能完成问卷调查或者抽血检测的有43名（3.0 %）,另外未满足研究纳入标准的有52名（3.6 %）,最终有1322名儿童完成了本研究的全部步骤。在三组人群基本情况比较中,年龄（p=0.027）和被动吸烟状态（p=0.001）显示有统计学差异,而性别比例、乙肝感染、身高体重指数（body mass index, BMI）、水消费量和水产品消费频率等均没有统计学差异（p﹥0.05）。2.肝损伤多因素回归分析问卷调查内容共包括6种危险因素,分别为BMI、HBV感染、MCs暴露、肝毒性药物、剧烈运动和被动吸烟。在具有统计学差异的危险因素中,OR值最大的是HBV感染（OR=7.589,p=0.001）,其次是肝毒性药物（OR=3.487,p=0.001）和MCs暴露（OR=1.719 , p=0.026） ,其他因素如被动吸烟（OR=1.476 , p=0.128）、BMI （OR=1.034/1.016,p=0.225）和剧烈运动（OR=0.852,p=0.483）在本研究中未发现与肝损伤存在关联。3.MC-LR内外暴露水平水中MC-LR浓度:20052009年,湖一和湖二水中MC-LR浓度的平均值分别为0.24μg （MC-LReq）/L和2.58μg （MC-LReq）/L,而井水中只在2008年检出,仅为0.1μg （MC-LReq）/L。其中2008年湖二水中MCs浓度最高,达到了4.3μg （MC-LReq）/L。水产品中MC-LR浓度:鱼禽肌肉和肝脏样本中均检测出了MC-LR,肝脏中MC-LR浓度均高于肌肉中MC-LR的浓度;对于同类水产品而言,湖二的水产品无论是肌肉中还是肝脏中MC-LR浓度均高于湖一的水产品;湖一和湖二水产品肌肉中MC-LR浓度平均值分别为0.10μg （MC-LReq）/g和0.22μg （MC-LReq）/g。人群血清中MC-LR浓度:高、低暴露组血清中MC-LR浓度范围分别为0.41.9μg （MC-LReq）/L和0.10.8μg （MC-LReq）/L,而对照组未检出;高暴露组MC-LR检出率为91.9%,显著高于低暴露组84.2%和对照组1.9%;高暴露组MC-LR平均浓度为1.3±0.2μg （MC-LReq）/L,显著高于低暴露组0.4±0.1μg （MC-LReq）/L,而对照组MC-LR平均浓度低于检测限,未检出。4.儿童每日MC-LR摄入量根据问卷调查和MC-LR检测结果比较,高、低暴露组中每名儿童每日通过饮水途径MC-LR摄入量分别为1.55μg MC-LReq和0.14μg MC-LReq;同时高、低暴露组每名儿童每日通过食用水产品摄入MC-LR量分别为0.48μg MC-LReq和0.22μg MC-LReq。因此,高、低暴露组儿童每日MC-LR的摄入量分别为2.03μg MC-LReq和0.36μg MC-LReq,高暴露组儿童每日摄入量已经高于WHO关于10kg儿童每天摄入0.4μg MC-LReq的限值。5.肝功酶检测结果三组人群肝功酶指标ALT、AST、GGT和ALP的平均值均在正常值范围内。高暴露组中AST和ALP均值分别为33.4±8.1 U/L和288.7±92.9 U/L,高于低暴露组的30.3±6.9 U/L和285.6±71.8 U/L及对照组的27.6±7.5 U/L和281.3±68.3 U/L,而且均有统计学差异（p=0.014,p=0.001）,三组间并未发现ALT和GGT存在统计学差异（p﹥0.05）。6.乙肝病毒检测结果整个人群HBV感染率为3.3%,HBsAg阳性率为3.3%,HBsAb阳性率为35.7%,HBeAg阳性率为2.0%,HBeAb阳性率为1.0%,HBcAb阳性率为3.3%。高、低暴露组和对照组的乙肝感染率分别为3.7%、2.2%和2.1%,未发现三组人群的感染率存在统计学差异（P=0.387）。二、GSTs基因多态性与MCs肝损伤易感性的病例对照研究1.病例组和对照组人群可比性病例组平均年龄为10.9±2.1岁,对照组为11.4±2.0岁,两组无统计学差异（P=0.13）。病例组中男性47人（58.0%）,每日饮水量1.1±0.3L,BMI为11.2±1.8。对照组中男性58（63.0%）人,每日饮水量1.2±0.2L,BMI为11.5±2.1。两组人群的性别组成、饮水量和BMI均无统计学差异（P﹥0.05）。2.基因型检测结果两组人群GSTM1基因型的分布没有统计学差异（p=1,χ2检验）,但病例组中GSTT1（-）的频率为60.5%,显著高于对照组的39.1%,且差异具有统计学意义（p=0.006） , GSTT1（-）可能是MCs致肝损伤的易感基因型。病例组中GSTM1（-）/GSTT1（-）频率为29.6%,高于对照组16.3%,而且GSTM1（-）/GSTT1（-）的个体发生肝损伤的危险度分别比GSTM1（+）/GSTT1（+）和GSTM1（-）/GSTT1（+）高3.01倍和2.54倍。结论:1.本研究首次检测了重庆市涪陵区乡镇儿童MCs内外暴露水平,部分儿童每日MCs摄入量已经超出WHO推荐限值。随着MCs暴露剂量的增大,肝功酶水平逐渐升高,需要引起人们的高度重视。2.同时发现在MCs暴露儿童中,GSTT1（-）可能是肝损伤的易感基因型,但未发现两组间GSTM1（-）的差异;GSTM1（-）/GSTT1（-）交互作用会增加发生肝损伤的危险性,导致暴露人群对MCs致肝损伤的易感性增强。本课题研究结果显示重庆市涪陵区部分乡镇存在MCs污染,而且已经影响儿童肝功能酶学水平,应加强涪陵区乡镇水环境中MCs监测和治理,以确保人民饮水健康。同时发现GSTT1（-）可能是肝损伤的易感基因型,GSTM1（-）/GSTT1（-）交互作用会增加发生肝损伤的危险性,为保护易感人群提供了依据,上述内容经文献检索,国内外未见类似的研究报道。同时本课题也存在一些不足,如在问卷调查中,发现部分儿童的父母感染过甲肝,而本研究中未对学生进行甲肝病毒感染的检测,在数据统计分析中可能会出现甲肝病毒感染的干扰;在MCs内外暴露的检测中,我们只检测了主要亚型MC-LR,而未检测其他亚型如MC-YR和MC-RR等,可能低估了MCs的暴露水平;在多因素回归分析中,剧烈运动的判定没有用精确的指标检测,而主要根据参加者的回答,可能会影响到数据的准确性。在今后的工作中,可以考虑继续检测GSTA1、GSTP1或者Ⅰ相代谢酶基因如细胞色素P450（CYP）超家族;另外,问卷调查的结果显示在MCs高暴露组中学生父母患癌症的有9人,肝癌4人,高于低暴露组和对照组,下步研究可以深入探讨MCs与肝癌的关系。
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