白色链霉菌JA3453中垩唑霉素生物合成基因簇部分功能区域的突变分析和中断研究

论文摘要

自二十世纪九十年代以来,分子克隆技术的日益成熟使得抗生素的研究发展到一个新的阶段。近年来,在世界范围内围绕抗生素生物合成基因簇的研究工作吸引了越来越多关注的目光,不断有新的抗生素合成基因簇被分离,其中最受瞩目的莫过于基因簇巨大并呈现模块结构的聚酮类、多肽类和杂合的聚酮非核糖体多肽类抗生素合成基因。获取抗生素生物合成的基因簇并进行测序后,利用模块或结构域增加、减少、替换等多种组合生物学手段设计和改造基因簇,形成一系列非天然的天然性化合物,将为抗生素品种的创新带来新的契机。其中,对聚酮的研究是最多也是最广泛的。聚酮的合成与脂肪酸的合成类似,都是经由聚酮合酶介导的简单羧酸单位（乙酸、丙二酸、丁酸等）的缩合过程。与聚酮抗生素合成相关的合成基因,调节基因及抗性基因在细菌基因组中往往紧密连锁,成簇排列。垩唑霉素是一类杂合的聚酮聚肽类抗生素,具有一定的抗病毒,抗癌和抗细菌活性。同位素示踪实验证实了垩唑霉素结构中二碳单位的来源,其中五个碳甲基,一个氧甲基和一个氮甲基基团来源于甲硫氨酸,但是C3-C4单位和C16-C13的来源还不清楚。在垩唑霉素的前期研究中,本实验室赵春华博士完整地克隆出垩唑霉素的合成基因簇。依据基因簇测序结果进行生物信息学分析后,提出了一个垩唑霉素生物合成的模型。在传统的I型聚酮类抗生素生物合成中,I型PKS由几个多功能的多肽组成,每一多肽上都携带有参与聚酮生物合成所必需的各种酶的结构域,每一结构域只能参与整个聚酮碳链合成中的一步生化反应,β-C原子的具体加工情况则完全依赖于某一结构域在这一合成酶单位上的存在与否。酰基转移酶（AT）、酮基合成酶（KS）,酰基载体蛋白（ACP）是一个二碳延伸单位所必不可少的酶。酮基还原酶（KR）、脱水酶（DH）或烯醇还原酶（ER）在此基础上分别进行再加工。因此PKS主序列上的活性位点的数量和排列与聚酮合成反应步骤呈一一对应的关系。但在垩唑霉素的PKS中我们发现,所有的模块中都缺少必须的AT,代替它行使功能的是位于ozmM这个基因所编码的双AT。除此之外,位于ozmH上的串联酮基合成酶（KS）也引起我们极大的兴趣。本研究的主要结果和结论如下:通过对ozmH上串联KS的活性位点的突变分析来检测各个KS在垩唑霉素生物合成中所发挥的作用。HPLC-MS分析显示,对第一个KS的定点失活并不会对垩唑霉素的产生带来影响。对串联KS中第二个KS的定点失活则完全剥夺了垩唑霉素的产生。这一结论显示在垩唑霉素生物合成中,存在着功能域的冗余。同时,在对KS进行定点诱变时,我们采用了一种新方法,首先定点诱变位点在RecA的介导下引入到含有大片段同源序列的cosmid上,再通过后续的接合转移筛选到合适的突变株。这一方法不依赖于常规的酶切反应,可被推广于难以找到合适酶切位点的定点诱变构建。同时,在垩唑霉素生物合成过程中,还存在两个调节基因ozmR和ozmU。对ozmR和ozmU分别采用目标PCR的方法进行基因中断以检测它们对垩唑霉素生物合成产量的影响。HPLC-MS分析结果显示,ozmR中断后垩唑霉素的生物合成产量提高了,由此可推测ozmR在垩唑霉素生物合成中是一个负调节基因。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 第二章 材料与方法
• 2.1 质粒与菌株
• 2.2 培养基
• 2.3 常规试剂及其他
• 第三章 方法
• 3.1 大肠杆菌质粒DNA 的小量提取
• 3.2 大肠杆菌和链霉菌质粒DNA 的少量快速提取及检测
• 3.3 感受态细胞制备
• 3.4 菌种保藏和链霉菌培养
• 3.5 DNA 片段的回收
• 3.6 电转化
• 3.7 两亲本杂交介导的质粒DNA 的跨属转移
• 3.8 双交换基因置换基因中断菌株的筛选
• 3.9 双交换基因中断或基因定点诱变菌株的鉴定和确认
• 3.10 双交换基因置换或基因中断菌株鉴定的聚合酶链式反应
• 3.11 垩唑霉素分离提纯和 HPLC-MS 检测
• 第四章 结果
• 4.1 白色链霉菌 JA3453 中串连 KS 结构域的发现和定点诱变分析
• 4.1.1 包含串连KS 结构域的ozmH 部分基因的克隆和体外定点诱变
• 4.1.1.1 包含串连KS 结构域的基因片断的克隆
• 4.1.1.2 串连KS 结构域的生物信息学分析
• 4.1.1.3 定点诱变的原理
• 4.1.1.4 引物设计和 PCR 定点诱变
• 4.1.2 在包含串连KS 结构域的cosmid pJTU1060 上分别引入定点突变
• 4.1.2.1 背景
• 4.1.2.2 将定点诱变位点引入到pKOV-kan 质粒上
• 4.1.2.3 RecA 介导的大肠杆菌内的双交换
• 4.1.3 构建分别在串连 KS 结构域附近插入抗性基因的突变株
• 4.1.3.1 前言
• 4.1.3.2 抗性基因分别插入到cosmid pJTU1060
• 4.1.4 突变株SDF7 和SDF8 的筛选和分离检测
• 4.2 白色链霉菌JA3453 中垩唑霉素生物合成基因簇调节基因的中断分析
• 4.2.1 调节基因ozmR 和ozmU 的生物信息学分析
• 4.2.2 调节基因ozmR 和ozmU 的基因中断
• 4.3 白色链霉菌JA3453 中垩唑霉素生物合成基因簇下游边界的确定
• 第五章 讨论
• 文献综述
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间发表的论著