论文摘要
溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis, UC）是一种高复发的肠道炎性疾病,是我国炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease, IBD）的主要临床形式之一。由于其发病机制不明,目前尚无有效防治措施,因此,研究UC的发病机制,探索有效的防治措施具有重要意义。目前认为UC发病是由于肠道共生菌及其产物突破肠黏膜屏障,诱导黏膜局部发生持续的免疫反应,引发组织炎症。正常情况下,肠道上皮细胞组成一道完整的黏膜屏障,阻止微生物及毒性大分子通过,可见肠黏膜屏障完整性是阻止细菌入侵及移位的关键。众所周知,紧密连接（Tight Junction, TJ）是细胞间的重要连接方式,对维持黏膜屏障的完整性起决定作用。因此,肠上皮紧密连接受损在UC的发病中扮演着关键角色。肠黏膜屏障功能缺陷时,微生物抗原可以进入肠黏膜固有层,从而诱导效应T细胞活化,启动黏膜免疫反应;研究发现,CD4+T细胞是肠黏膜炎症反应的主要效应细胞,其辅助细胞亚群——Th17细胞以分泌白细胞介素17（IL-17）为主,后者是一种促炎因子,具有强大的募集和激活嗜中性粒细胞的能力,能诱导活化T细胞产生多种促炎介质如IL-1、IL-6、TNF-α等而诱发加重炎症反应。因此,深入探讨UC发病中肠黏膜屏障的作用与免疫调节机制具有重要意义。1,25-二羟基维生素D3（1,25-dihydroxyvitamin D3, 1,25（OH）2D3）是机体内维生素D的活性形式,也是一种具有生物活性的类固醇激素,具有明确的抗感染作用,其缺乏可致呼吸道、消化道黏膜等部位感染风险明显增高。研究显示,1,25（OH）2D3可抑制炎性细胞因子、上调紧密连接蛋白的表达。同时,1,25（OH）2D3也具有免疫调节作用,流行病学研究表明,在混合型结缔组织病患者中1,25（OH）2D3缺乏明显,其中1,25（OH）2D3的缺乏程度与血清中IFN-γ、IL-6、IL-17含量呈正比。1,25（OH）2D3的产生与作用不足可能参与了UC的发病,我们推测1,25（OH）2D3可能通过调节肠道紧密连接蛋白表达,从而维持黏膜屏障完整性,抑制致病菌入侵及移位,因此,本实验对1,25（OH）2D3在急、慢性期实验性结肠炎肠黏膜屏障中的保护作用与机制进行了深入研究,具体实验分为以下四部分:第一部分:1,25-二羟基维生素D3改善急、慢性期实验性结肠炎小鼠肠黏膜炎症目的:观察1,25（OH）2D3对急、慢性期实验性结肠炎小鼠肠黏膜炎症的影响。方法:①通过饮用2%右旋葡聚糖硫酸钠（Dextran sodium sulfate, DSS）7天可以成功建立急性期实验性结肠炎模型,C57B/L小鼠随机分为正常对照组、模型组、1,25（OH）2D3组,每组10只;1,25（OH）2D3组应用1,25（OH）2D3灌胃（0.2μg/25 g体重,1次/天）,正常对照组和模型组均用等体积PBS灌胃,共14天。慢性期实验性结肠炎模型则通过在第15天、812天、1519天和2226天的时间段内饮用2%的DSS,第27、28天及其它时间饮用蒸馏水成功建立,C57B/L小鼠随机分为3组:正常对照组、模型组、1,25（OH）2D3组,每组10只。1,25（OH）2D3组在模型建立第14天时即给予1,25（OH）2D3（0.005μg/d,1次/d,溶于花生油中）灌胃,正常对照组及模型组以同体积的花生油灌胃,第29天处死动物;②肠黏膜炎症改变的评估包括每天体重（Body weight, BW）改变、疾病活动指数（Disease activity index, DAI）、结肠长度、重量变化等指标,以及结肠形态学改变和病理评分;③采用扫描电镜观察结肠组织上皮黏膜超微结构变化。结果:①在急性期结肠炎小鼠模型中,与正常对照组相比,模型组动物体重明显减轻,给予1,25（OH）2D3干预后,1,25（OH）2D3组动物体重较模型组明显回升;模型组动物DAI评分（3.00±0.41 vs 0.00±0.00,P<0.01）及病理评分明显增加（8.60±1.67 vs 5.00±0.00,P<0.01）明显高于正常对照组,结肠长度缩短（4.88 cm±0.63 cm vs 6.80 cm±0.27cm,P<0.01）,结肠壁充血、水肿明显（2.00±0.71 vs 0.00±0.00,P<0.01）,结肠组织病理切片显示中性粒细胞浸润明显;但给予1,25（OH）2D3干预后,1,25（OH）2D3组DAI评分（0.00±0.00 vs 0.70±0.41,P<0.01）及病理评分（7.40±0.55 vs 8.60±1.67,P<0.01）较模型组显著降低,同时结肠长度有所增长（6.10 cm±0.42 cm vs 4.88 cm±0.63 cm,P<0.01）,结肠壁充血及水肿明显减轻（0.60±0.55 vs 2.00±0.71,P<0.01）,结肠组织病理切片提示中性粒细胞浸润明显减少;②在慢性期实验性结肠炎小鼠模型中,与正常对照组相比,模型组动物体重明显减轻,经1,25（OH）2D3干预后,1,25（OH）2D3组动物体重较模型组明显回升;与正常对照组相比,模型组动物DAI积分增加（4.00±0.43 vs 0.00±0.00,P<0.01）,结肠长度明显缩短（5.03 cm±0.56 cm vs 5.98 cm±0.44 cm,P<0.01）,结肠壁充血、水肿明显（2.17±0.98 vs 0.00±0.00,P<0.01）,结肠组织病理切片显示中性粒细胞、淋巴细胞浸润明显,直肠、近端结肠、末端回肠病理评分显著增加（8.80±0.45 vs 5.40±0.55、9.80±0.45 vs 5.40±0.55、8.80±0.84 vs 5.40±0.55,P<0.01）;但经过1,25（OH）2D3干预后,1,25（OH）2D3组DAI评分显著降低（0.30±0.46 vs 0.70±0.30,P<0.01）,结肠长度增加不明显（5.27±0.46 vs 5.03±0.56,P>0.05）及直肠、近端结肠、末端回肠病理评分较模型组明显降低（8.60±0.55 vs 8.80±0.45、9.00±0.71 vs 9.80±0.45、8.00±0.89 vs 8.80±0.84,P<0.05）,结肠壁充血、水肿明显减轻（1.33±0.52 vs 2.17±0.98,P<0.01）,结肠组织病理切片结果提示淋巴细胞浸润明显减少;③扫描电镜（Scanning electron microscope, SEM）观察结果表明,正常对照组小鼠结肠组织上皮完整,无损伤;模型组则表现为典型炎症黏膜紊乱,部分黏膜缺失,但经过1,25（OH）2D3干预后,1,25（OH）2D3组黏膜缺失较模型组减轻,偶见隐窝扩大。结论:1,25（OH）2D3可以减轻急、慢性期UC小鼠肠黏膜炎症反应。第二部分:1,25-二羟基维生素D3对急、慢性期实验性结肠炎肠黏膜屏障的保护作用目的:观察1,25（OH）2D3对急、慢性期实验性结肠炎模型小鼠结肠黏膜屏障的保护作用。方法:①造模方法同第一部分;②对各组动物肠系膜淋巴结匀浆液进行细菌培养以明确有无大肠杆菌感染;③通过荧光分光光度计检测小鼠血清中异硫氢酸荧光素葡聚糖（fluorescein isothiocyanate-dextran, FITC-D）的含量;偶氮基质显色法检测血清中脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）含量;④采用免疫组织化学染色法、免疫荧光染色法、western blot和real-time Q-PCR技术检测急、慢性期模型各组小鼠结肠组织中闭锁蛋白（occludin）、水闸蛋白（claudin）和闭锁小带（zonula occludens, Zos）蛋白及其mRNA的表达。结果:①与正常对照组相比,模型组小鼠血清中FITC-D和LPS的含量显著增加（FITC-D:933.4±133.5 vs 4266.8±326.6,P<0.01;LPS:0.119±0.05 vs 0.224±0.06,P<0.01）;而1,25（OH）2D3组小鼠血清中FITC-D和LPS的含量较模型组明显降低（FITC-D:253.4±222.9 vs 4266.8±326.6,P<0.01;LPS:0.138±0.06 vs 0.224±0.06,P<0.01）。②正常对照组小鼠肠系膜淋巴结匀浆液中无细菌移位（0 %）,与正常对照组相比,模型组小鼠细菌移位率明显增加（80 %）,而1,25（OH）2D3组,淋巴结细菌移位较模型组明显降低（40 %）。③免疫组织化学染色及免疫荧光染色检测结果显示:急、慢性期模型组小鼠肠组织中zo-1、occludin和claudin-1蛋白表达水平较正常对照组显著降低,而1,25（OH）2D3组zo-1、occludin和claudin-1蛋白表达水平较模型组明显增加。④Western blot和real-time Q-PCR检测结果显示:在急性期小鼠模型中,与正常对照组相比,模型组小鼠结肠组织中zo-1、occludin和claudin-1蛋白和mRNA表达明显降低（蛋白:0.60±0.05 vs 1.37±0.04、0.11±0.01 vs 0.25±0.03、0.44±0.04 vs 0.95±0.04,P<0.05;mRNA:0.46±0.03 vs 1.00±0.07、0.36±0.02 vs 1.00±0.04和0.85±0.05 vs 1.00±0.05,P<0.01）;而1,25（OH）2D3组与模型组比较小鼠结肠组织中zo-1、occludin和claudin-1蛋白和mRNA表达明显增加（蛋白:1.31±0.15 vs 0.60±0.05、0.23±0.03 vs 0.11±0.01、0.93±0.01 vs 0.44±0.04,P<0.05;mRNA:0.97±0.04 vs 0.46±0.03、0.98±0.01 vs 0.36±0.02、1.00±0.04 vs 0.85±0.05,P<0.01）。在慢性期小鼠模型中:与正常对照组相比,模型组小鼠直肠、近端结肠、末端回肠组织中zo-1、occludin和claudin-1蛋白（zo-1:0.98±0.03 vs 1.56±0.02、0.34±0.03 vs 0.76±0.020、0.24±0.02 vs 0.65±0.03,P<0.01;occludin:1.48±0.03 vs 1.56±0.03、1.64±0.02 vs 1.76±0.03、1.44±0.03 vs 1.65±0.02,P<0.01;claudin-1:1.10±0.03 vs 1.36±0.03、1.04±0.02 vs 1.66±0.03、1.44±0.03 vs 1.85±0.02,P<0.01）和mRNA（zo-1:0.83±0.05 vs 1.03±0.05、0.60±0.04 vs 1.01±0.05、0.69±0.03 vs 1.02±0.05,P<0.01;occludin:0.90±0.04 vs 1.01±0.05、0.93±0.04 vs 1.03±0.05、0.90±0.05 vs 1.04±0.05,P<0.01;claudin-1:0.77±0.02 vs 1.02±0.05、0.55±0.02 vs 1.01±0.05、0.66±0.03 vs 1.04±0.05,P<0.01）表达水平明显下降;而1,25（OH）2D3组与模型组小鼠比较直肠、近端结肠、末端回肠组织中zo-1、occludin和claudin-1蛋白（zo-1:1.35±0.02 vs 0.83±0.05、0.63±0.02 vs 0.34±0.03、0.55±0.02 vs 0.24±0.02,P<0.01;occludin:1.45±0.02 vs 1.48±0.03、1.63±0.02 vs 1.64±0.02、1.56±0.02 vs 1.44±0.03,P<0.01;claudin-1:1.25±0.02 vs1.10±0.03、1.43±0.02 vs 1.04±0.02、1.65±0.02 vs 1.44±0.03,P<0.01）和mRNA（zo-1:0.94±0.02 vs 0.83±0.05、0.67±0.01 vs 0.60±0.04、0.74±0.01 vs 0.69±0.03,P<0.01;occludin:0.94±0.02 vs 0.90±0.04、0.94±0.03 vs 0.93±0.04、0.94±0.01 vs 0.90±0.05,P<0.01;claudin-1:0.84±0.02 vs 0.77±0.02、0.77±0.02 vs 0.55±0.02、0.74±0.01 vs 0.66±0.03,P<0.01）表达水平明显增加。结论:1,25（OH）2D3有助于改善炎症引起的肠道黏膜损伤,其机制可能与降低肠黏膜屏障的通透性、维持黏膜屏障结构和功能有关。第三部分:1,25-二羟基维生素D3对慢性期实验性结肠炎CD4+T细胞功能的影响目的:探讨1,25（OH）2D3对DSS诱导的慢性期实验性结肠炎模型小鼠CD4+T细胞功能的影响。方法:①观察脾脏长度、脾脏重量变化;②分离脾脏单个核细胞数并计数,应用流式细胞术检测脾脏单个核细胞中免疫细胞的阳性率;③分离结肠黏膜固有层、肠系膜淋巴结中单个核细胞数并计数;④应用real-time Q-PCR技术分析结肠组织中炎性细胞因子TNF-αmRNA、IFN-γmRNA、IL-17 mRNA、IL-6 mRNA的表达变化。结果:①同正常对照组相比,DSS模型组小鼠脾脏长度、重量增加,（脾脏长度:1.37 cm±0.27 cm vs 1.22 cm±0.12 cm,P>0.05;脾脏重量:0.09 g±0.02 g vs 0.06 g±0.02 g,P>0.05）而给予1,25（OH）2D3干预后,同DSS模型组相比,小鼠脾脏长度稍下降、重量稍减轻（脾脏长度:1.32 cm±0.12 cm vs 1.37 cm±0.27 cm;脾脏重量:0.084 g±0.02 g vs 0.09 g±0.02 g）但均P>0.05,无统计学意义;②细胞计数结果显示,1,25（OH）2D3组脾脏单个核细胞数量较DSS模型组显著减少（76.80×106±18.60×106/mL vs 108.00×106±20.30×106/mL,P<0.01）;进一步采用流式细胞术检测脾脏单个核细胞中免疫细胞所占的阳性比率,结果显示给予1,25（OH）2D3干预后,小鼠脾脏单个核细胞中CD3、CD4、CD8、CD45R细胞阳性率与模型组比较显著降低（36.58 %±0.70 % vs 54.10 %±0.97 %、19.80 %±0.73% vs 29.02 %±0.68 %、14.40 %±0.70 % vs 18.82 %±0.54 %、26.82 %±0.47 % vs 54.40 %±0.87 %,P<0.01）;③给予1,25（OH）2D3干预后,1,25（OH）2D3组小鼠肠系膜淋巴结（Mesenteric lymph node,MLN）和结肠黏膜固有层单个核细胞（Lamina propria mononuclear cells,LPMC）数量与模型组相比显著降低（MLN:2.52×106/mL±0.74×106/mL vs 3.42×106/mL±0.40×106/mL,P<0.01;LPMC:0.32×106/mL±0.14×106/mL vs 0.88×106/mL±0.08×106/mL,P<0.01）;④Real-time Q-PCR检测结果显示,与DSS模型组相比,给予1,25（OH）2D3干预后,1,25（OH）2D3组结肠组织中TNF-αmRNA、IFN-γmRNA、IL-17 mRNA和IL-6 mRNA表达水平均显著降低（5.48±0.08 vs 9.30±0.07、7.74±0.11 vs 14.38±0.08、3.28±0.11 vs 6.38±0.08、4.54±0.10 vs 7.38±0.07,P<0.01）。结论:1,25（OH）2D3可减轻DSS诱导的小鼠慢性期结肠炎的肠损伤,其机制可能与降低脾脏单个核细胞中免疫细胞的阳性率以及抑制肠组织中的TNF-α、IFN-γ、IL-17、IL-6等细胞因子有关。第四部分:1,25-二羟基维生素D3对体外Caco-2细胞屏障的保护作用与机制研究目的:探讨1,25（OH）2D3对DSS诱导的体外培养的Caco-2细胞屏障的保护作用与机制研究。方法:①Caco-2细胞形成体外肠上皮细胞屏障模型后,实验分为vehical组（溶剂对照组）、DSS组、1,25（OH）2D310-9M组、1,25（OH）2D310-8M组和1,25（OH）2D310-7 M组;②通过测量单层上皮的电阻（Transepithelial electrical resistance, TEER）和荧光素异硫氰酸酯葡聚糖（Fluorescein isothiocyanate dextran, FITC-D）通透率检测单层细胞的电阻与通透率改变;③应用透射电镜观察1,25（OH）2D3干预后Caco-2单层细胞的超微结构改变;④采用免疫荧光染色方法、Western blot技术和real-time Q-PCR方法检测zo-1、occludin和claudin-1的蛋白及其mRNA在单层细胞的表达。结果:①体外肠上皮细胞屏障模型成功建立;②对FITC-D通透率的结果分析显示:DSS组较vehical组明显升高（51.83±2.48 vs 5.5±1.05,P<0.01）,1,25（OH）2D310-9 M组、1,25（OH）2D310-8 M组和1,25（OH）2D310-7 M组则较DSS组显著降低（18.5±1.05, 8.17±1.17, 18.5±1.05,P<0.01）;进一步采用透射电镜观察,显示DSS组细胞的紧密连接样结构消失,而1,25（OH）2D3各剂量组细胞的紧密连接样结构有不同程度的恢复,但仍未能完全恢复正常;③免疫荧光染色结果表明:vehical组zo-1、occludin和claudin-1蛋白表达连续完整,荧光密度强度高;DSS组上述三种蛋白表达断续不完整,荧光强度弱;而1,25（OH）2D310-9M组、1,25（OH）2D310-8 M组和1,25（OH）2D310-7 M组较DSS组明显好转;④Western blot对zo-1、occludin、claudin-1蛋白检测结果显示:DSS组较vehical组显著降低（0.80±0.16 vs 1.51±0.20、0.99±0.13 vs 1.66±0.14、0.76±0.09 vs 1.79±0.11,P<0.01）,而给予1,25（OH）2D310-8 M治疗后,其紧密连接zo-1、occludin和claudin-1蛋白表达水平明显高于DSS组（1.20±0.12 vs 0.80±0.16、1.47±0.13 vs 0.99±0.13、1.68±0.11 vs 0.76±0.09,P<0.01）,1,25（OH）2D310-9 M,1,25（OH）2D310-7 M干预后,其紧密连接occludin和claudin-1蛋白的表达水平与DSS组相比明显增加,P<0.01;但1,25（OH）2D310-9 M,1,25（OH）2D310-7 M干预后,zo-1蛋白表达水平与DSS组相比无明显增加,P>0.05;Real-time Q-PCR检测结果显示:DSS组较vehical组显著降低（0.67±0.11 vs 1.00±0.00、0.63±0.07 vs 1.00±0.00、0.70±0.07 vs 1.00±0.00,P<0.01）,而给予1,25（OH）2D310-8 M治疗后,其紧密连接zo-1 mRNA、occludin mRNA、claudin-1 mRNA表达水平与DSS组相比,明显增加（0.84±0.08 vs 0.67±0.11、0.84±0.08 vs 0.63±0.07、0.9±0.08 vs 0.70±0.07,P<0.01）,1,25（OH）2D310-9 M,1,25（OH）2D310-7 M干预后,其紧密连接zo-1 mRNA、occludin mRNA、claudin-1 mRNA的表达水平与DSS组相比也明显增加,P<0.01。结论:体外研究表明,1,25（OH）2D3有助于维持DSS所介导的Caco-2单层细胞紧密连接结构和肠上皮屏障功能,从而降低单层细胞的通透性,发挥保护Caco-2单层细胞的作用
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