疣孢漆斑菌原生质体制备、再生和诱变育种研究

论文摘要

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,能催化酚类化合物的氧化,广泛地应用于工农业生产中。为了获得高产菌株,本文研究了产漆酶疣孢漆斑菌Ws2-6原生质体制备与再生的影响因子,在此基础上用NTG对制备的原生质体进行诱变,筛选了高酶活的优良菌株,并优化了产酶条件。通过对酶的种类、酶的组合、酶液浓度、酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂等因素的研究获得了制备疣孢漆斑菌Ws2-6原生质体的有效条件。采用0.7 mol/L氯化钠为渗透压稳定剂,在pH6的磷酸缓冲体系中,以15 mg/ml溶壁酶、5 mg/ml纤维素酶R-10和10 mg/ml蜗牛酶的混合酶液处理培养18h的菌丝体,30℃、80 r?min振荡酶解6小时,原生质体产生量达到最大值7.83×106个/ml。在单层PDA培养基上30℃培养, Ws2-6原生质体形成率达82 %,再生率为8.7 %。此外,对原生质体释放的跟踪观察发现,疣孢漆斑菌原生质体释放有顶端、侧端释放两种方式。以NTG为诱变剂处理原生质体,采用含致死剂量的愈创木酚选择性平板筛选了高产漆酶菌株。确定了愈创木酚对Ws2-6的致死浓度为0.2 %。NTG对疣孢漆斑菌Ws2-6的原生质体进行诱变处理,利用平板初筛和摇瓶复筛,获得了三株酶活提高的突变菌株N-001、N-003和N-004,产酶活力由原来的750 U/ml提高到1300 U/ml、1825 U/ml和3075 U/ml。突变菌株经过5代传代,酶活稳定。通过单因素实验分析了影响酶活的因素,获得了最佳产酶条件。三株突变菌产酶的最适碳源均为葡萄糖,其酶活最高值分别为1325 U/ml、1675 U/ml和2925 U/ml;Ws2-6最适氮源为酵母粉,其酶活最高值分别为1525 U/ml、1950 U/ml和5525 U/ml;检测了Azure-B、ABTS、碱木素和愈创木酚对突变菌株的诱导作用,结果发现,均能促进突变株N-001产酶,其最佳诱导作用的物质为Azure-B,酶活可达1575 U/ml;N-003的最佳诱导作用的物质为Azure-B,酶活可达1825U /ml,其余几种均有不同程度的抑制作用;N-004的最佳诱导作用的物质为Azure-B,酶活可达3075 U/ml,ABTS有一定得促进作用,而其余几种均有不同程度的抑制作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 文献综述
• 1 引言
• 1.1 研究目的与意义
• 1.2 本文拟解决的问题
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 仪器
• 2.1.5 试剂的配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 疣孢漆斑菌原生质体的制备
• 2.2.2 原生质体的形成率
• 2.2.3 再生率的测定
• 2.2.4 Ws2-6 菌株的诱变育种
• 2.2.5 生物量的测定
• 2.2.6 营养成分对突变菌株产酶的影响
• 3 结果和分析
• 3.1 影响疣孢漆斑菌原生质体形成的因素
• 3.1.1 不同酶组合对原生质体形成的影响
• 3.1.2 不同pH 值对原生质体形成的影响
• 3.1.3 酶解时间对原生质体形成的影响
• 3.1.4 不同酶解温度对原生质体形成的影响
• 3.1.5 不同稳定剂对原生质体形成的影响
• 3.2 原生质体的纯化
• 3.3 原生质体释放的观察
• 3.4 原生质体的形成及再生
• 3.5 愈创木酚致死浓度的测定
• 3.6 亚硝基胍（NTG）诱变育种
• 3.7 突变株的遗传稳定性测定
• 3.8 营养成分对突变菌株产酶的影响
• 3.8.1 不同碳源对菌株N-001、N-003、N-004 产酶的影响
• 3.8.2 不同氮源对菌株N-001、N-003、N-004 产酶的影响
• 3.8.3 不同金属离子对菌株N-001、N-003、N-004 产酶的影响
• 3.8.4 不同物质对菌株N-001、N-003、N-004 产酶的诱导作用
• 3.8.5 表面活性剂对菌株N-001、N-003、N-004 产酶的影响
• 4 讨论
• 4.1 疣孢漆斑菌菌丝体的制备
• 4.2 疣孢漆斑菌的原生质体的制备
• 4.3 疣孢漆斑菌的诱变育种
• 4.4 疣孢漆斑菌突变菌株发酵条件的研究
• 5. 结论
• 5.1 Ws2-6 原生质体制备条件
• 5.2 Ws2-6 再生条件
• 5.3 Ws2-6 原生质体致死浓度的测定
• 5.4 NTG 对Ws2-6 原生质体的诱变育种
• 5.5 突变株N-001、N-003 和N-004 产酶条件的研究
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 发表论文