抗矮花叶病RNA干扰表达载体构建及玉米茎尖转化

论文摘要

玉米矮花叶病是由玉米矮花叶病毒引起的系统性病害。近年来,它已成为我国玉米的一种主要病害,极大限制了我国各地区玉米的产量。已确认导致我国玉米矮花叶病的病原有：玉米矮花叶病毒（MDMV）、甘蔗花叶病毒（SCMV）、约翰逊草花叶病毒（JGMV）及高粱花叶病毒（SrMV）。它们都靠蚜虫以非持久性方式进行传播,而且在传播时间、路线及规模等特点上都没有规律可循,所以采用农业防治和化学控制收效甚微。利用转基因技术对玉米进行遗传改良,培育抗病品种是防治玉米矮花叶病最有效的途径。过去常用的反义RNA抑制方法抗病效果不够理想。而RNA干扰（RNAinterference, RNAi）介导的病毒抗性,具有抗病程度高、特异性强、遗传性稳定等优点,已转化培育出抗多种作物病毒病的转基因株系。目前,玉米大规模转基因操作主要运用基因枪和农杆菌介导两种方法。这两种方法各具优点,又都有难以克服的不足之处,共同的困难是都以愈伤组织为受体,其诱导和培养受玉米基因型和取材季节的限制很大,且培养、转化、筛选和再生的周期较长,转基因操作的规模一般较小,难以保证转化成功。不依赖于组织培养的规模化转基因技术,是玉米转基因研究有待突破的一个关键环节。本研究依据RNAi原理,构建与玉米矮花叶病毒衣壳蛋白基因同源的RNAi表达载体,农杆菌介导法转化玉米茎尖生长点,以期获得抗矮花叶病的转基因抗病毒玉米材料。对玉米矮花叶病毒的CP基因进行同源性分析,选取保守区404 bp序列作为RNAi靶片段,进行体外合成。设计正、反向引物各一对,分别扩增片段,将正、反向片段插入中间载体pSK-int中,构成具有“发卡结构”的中间载体。用限制性内切酶切割pC1300UbiDREB载体的Ubiquitin启动子和T-nos序列,将其分别插入到pTF101.1载体中。然后将上述中间载体中的反向重复序列插入改造后的pTF101.1载体,构建成RNAi表达载体。限制性酶切分析和反向重复序列片段的序列测定证明,与玉米矮花叶病毒CP基因同源的反向重复序列已插入改造后的pTF101.1载体,RNAi载体pTFAsC404的表达结构正确,可用于玉米的遗传转化。以“18-599白”的茎尖为受体,通过农杆菌介导法将其进行原位转化,获得转化苗约1140株。经0.2 g/L除草剂筛选后,存活的转化苗525株。将抗性苗移入大田后,利用CTAB法提取基因组DNA,然后对其进行目的基因的PCR扩增,将阳性的PCR产物进行测序,测序结果与目的基因片段一致。结果显示12株幼苗呈阳性,芽尖转化率为1.05%。上述结果表明,以玉米茎尖为受体的农杆菌介导法遗传转化体系具有可行性,而且操作简便,比依赖与愈伤组织作受体的转化少用一个生长季节,转化获得的转基因株系经进一步鉴定后可用于转基因抗病品种培育。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 玉米矮花叶病的概况
• 1.1.1 玉米矮花叶病的危害
• 1.1.2 症状与病原
• 1.1.3 发病规律及防治
• 1.1.4 玉米矮花叶病抗性遗传研究
• 1.2 RNA干扰机理及应用
• 1.2.1 RNA干扰的发现
• 1.2.2 RNA干扰的机理及其特点
• 1.2.3 RNA干扰在抗病毒基因工程中的应用
• 1.3 玉米遗传转化的研究进展
• 1.3.1 玉米受体系统的研究
• 1.3.2 玉米遗传转化的方法
• 1.3.3 外源基因的整合、表达和遗传
• 1.4 本研究的目的
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 细菌、质粒和引物
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 抗生素
• 2.2 载体构建
• 2.2.1 目的片段的获得
• 2.2.2 中间载体的构建
• 2.2.3 pTF101.1载体的改造
• 2.2.4 RNAi载体构建
• 2.2.5 RNAi表达载体转化农杆菌
• 2.2.6 茎尖农杆菌转化
• 2.2.7 转化植株的鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 含正向序列的中间载体pSK-int
• 3.2 含反向重复序列的中间载体pSK-int
• 3.3 改造的pTF 101.1载体
• 3.4 RNAi表达载体pTFAsC404
• 3.5 农杆菌转化子
• 3.6 茎尖农杆菌转化及转化苗的除草剂筛选
• 3.7 转基因植株PCR检测与测序
• 4 讨论
• 4.1 以茎尖为受体的转化率
• 4.2 MDMV CP基因反向重复序列表达载体的构建
• 4.3 农杆菌茎尖转化
• 参考文献
• 致谢