论文摘要
研究目的:考察具有阳离子型和温度敏感性的泊洛沙姆壳聚糖接枝物纳米胶束的理化性质,并探讨影响模型抗原的巨噬细胞与树突状细胞摄取的因素,以便为新型疫苗载体的研究提供实验依据。实验方法:本研究利用1-乙基-3-（3-二甲基丙基）-碳二亚胺（EDC）和N-羟基-丁二酰亚胺（NHS）介导反应,合成泊洛沙姆-壳聚糖接枝物,通过核磁共振图谱（1H-NMR）和红外光谱图（FT-IR）验证中间体及产物的结构。采用芘荧光探针法和可见分光光度法测定了接枝物的临界胶束浓度（CMC）和最低临界溶液温度（LCST）。采用直接分散法制备含OVA的聚合物纳米胶束,BCA法测定纳米胶束的载药量和包封率,并以粒径、载药量和包封率作为指标筛选工艺与处方。探讨纳米胶束在37℃和4℃条件下的体外释放行为,并通过MTT法考察泊洛沙姆壳聚糖接枝物的细胞毒性。体外诱导小鼠骨髓中单个核细胞使其分化形成树突状细胞,通过荧光显微镜和流式细胞仪考察巨噬细胞和树突状细胞对纳米粒的摄取情况。实验结果:红外光谱图和核磁共振分析结果确证了中间体及泊洛沙姆壳聚糖接枝物的合成,热分析结果进一步验证了泊洛沙姆壳聚糖接枝物的形成。当Poloxamer与CS投药质量之比为0.63:0.025时,所制得的聚合物CMC值为（3.24±0.06）×10-6 mol·L-1,LCST在37℃附近。在优选的纳米胶束制备工艺与处方条件下,所制得载药纳米胶束粒径为（219.1±2.3） nm,OVA的包封率和载药量分别为（42.2±5.6）%和（21.4±2.3）%,且重现性良好。载药纳米胶束的Zeta-电位为（11.67±2.25） mV。负载OVA的胶束在37℃条件下的4h累积释放为30%,但在4℃条件下4 h即可达到释放完全。MTT结果表明,聚合物胶束的细胞毒性低。荧光显微镜和流式细胞仪的结果显示,巨噬细胞和树突状细胞对FITC-OVA纳米胶束的摄取率明显高于溶液态FITC-OVA。结论:泊洛沙姆接枝壳聚糖形成的纳米胶束具有温度敏感性和阳离子特征,且细胞毒性低,可显著提高所负载模型抗原FITC-OVA的抗原递呈细胞摄取率。以提高Po-CS胶束的树突状细胞靶向为目的的单克隆抗体修饰正在进行中。
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中文摘要Abstract第一章 文献综述1 聚合物胶束1.1 聚合物胶束的概念1.2 聚合物胶束的种类1.3 聚合物胶束的特点2 聚合物胶束的制备和载药方法2.1 胶束的制备2.2 载药方法3 聚合物胶束的表征3.1 胶束粒径及粒径分布3.2 形态学观察3.3 临界胶束浓度（CMC）4 智能型纳米胶束4.1 温度敏感型4.2 pH 敏感型4.3 pH-温度双敏感型4.4 光敏感型4.5 超声敏感型5 Poloxamer 及 CS 介绍6 本研究的意义和目的第二章 泊洛沙姆接枝壳聚糖聚合物的合成1 实验仪器和试剂1.1 实验试剂1.2 实验仪器2 实验方法2.1 壳聚糖的纯化2.2 壳聚糖脱乙酰度的测定2.3 合成路线2.4 合成步骤2.5 热重分析2.6 临界胶束浓度（CMC）的测定2.7 低临界溶液温度（LCST）的测定3 实验结果3.1 壳聚糖（分子量50,000-60，000）脱乙酰度的测定3.2 合成过程中的中间产物的表征3.3 热重分析结果3.4 聚合物溶液的临界胶束浓度（CMC）3.5 聚合物的低临界溶液温度（LCST）4 本章小结第三章 OVA-PO-CS 纳米胶束的制备及制剂学评价1 实验材料和方法1.1 实验试剂1.2 实验仪器2 试液的配制3 实验方法3.1 蛋白质测定方法的建立3.2 纳米胶束的制备与表征3.3 影响因素考察3.4 包封率及载药量的测定3.5 体外释放4 实验结果与讨论4.1 标准曲线4.2 加样回收率结果4.3 影响因素考察结果4.4 优化处方的确定及评价4.5 体外释放5. 本章小结第四章 巨噬细胞和树突状细胞对纳米胶束的摄取1 实验材料和仪器1.1 实验试剂1.2 实验仪器1.3 细胞株1.4 实验动物2 溶液的配制3 实验方法3.1 异硫氰酸荧光素（FITC）标记OVA3.2 含有FITC-OVA 的胶束的制备以及评价3.3 细胞对于纳米胶束的摄取实验3.4 数据分析4 实验结果4.1 OVA-FITC 性质的测定4.2 荧光分析方法的确立4.3 含有FITC-OVA 的纳米粒的粒径和载药量4.4 DC 体外培养的生长情况及表型测定4.5 细胞毒性实验4.6 细胞摄取实验5 本章小结全文结论和展望参考文献攻读硕士学位期间公开发表的论文致谢
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