秋茄KcBURP基因及KcC2H2型锌指蛋白基因的克隆及功能分析

论文摘要

秋茄（Kandelia candel（L.）Druce）是红树的一种,属于非泌盐型红树,长期生活在海边,具有很强的耐盐性。前期研究显示,秋茄苗木KcBURP基因与KcC2H2型锌指蛋白基因在盐胁迫下表达明显上调,提示这两个基因可能对秋茄耐盐性有所贡献。本文以秋茄为材料,利用前期Microarry分析所获得的KcBURP及KcC2H2型锌指蛋白基因的cDNA序列设计引物,通过RT-PCR,获得这两个基因cDNA的开放读码框（ORF）。序列分析结果显示KcBURP基因的ORF长1131bp,编码一个等电点为9.07、分子量为39.8kD、由375个氨基酸组成的多肽蛋白。KcC2H2型锌指蛋白基因ORF长738bp,由245氨基酸组成,蛋白分子量约26.1kD,理论等电点为8.65。将秋茄KcBURP基因构建到植物表达载pCAMBIA-2300中,转化烟草。选取10个卡那霉素抗性株系进行基因组PCR鉴定,数据表明其中的8个株系为转基因株系。PT-PCR的结果显示在2个转基因株系中KcBURP得到过表达。150 mM NaCl处理后,野生型明显萎蔫,过表达转基因植株长势良好。进一步对野生型和转基因烟草进行光合作用测定,结果显示100mM盐处理显著降低了野生型烟草的净光合速率,而对转基因植株叶片的光合作用影响较小。盐浓度达到200mM时,转基因植株及野生型烟草净光合速率都明显降低,盐胁迫解除后,转基因烟草光合作用的恢复情况明显好于野生型烟草。说明KcBURP的过表达提高了烟草的抗盐性。另外,将KcC2H2型锌指蛋白基因全长cDNA构建到pK7WG2D上,转化烟草,选取8个株系进行基因组PCR鉴定,初步鉴定获得转基因植株。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 红树的抗盐分子机制研究进展
• 1.1.1 红树抗盐基因研究进展
• 1.2 BURP蛋白家族研究进展
• 1.2.1 BURP蛋白家族及其结构特征
• 1.2.1.1 BURP蛋白种类
• 1.2.1.2 BURP蛋白结构特征
• 1.2.2 BURP家族蛋白功能
• 1.2.2.1 BURP与植物生长发育
• 1.2.2.2 BURP与植物生长及抗逆
• 1.3 植物C2H2型锌指蛋白研究进展
• 1.3.1 植物C2H2型锌指蛋白的结构及对靶DNA的识别
• 1.3.1.1 植物C2H2型锌指蛋白的结构
• 1.3.1.2 植物C2H2型锌指蛋白对靶DNA的识别
• 1.3.2 植物C2H2型锌指蛋白功能
• 1.3.2.1 C2H2型锌指蛋白与植物生长发育
• 1.3.2.2 C2H2型锌指蛋白与植物抗逆
• 1.4 本研究目的及意义
• 1.5 本研究的主要内容
• 2 秋茄KcBURP蛋白基因的克隆及功能分析
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 质粒
• 2.1.3 菌株
• 2.1.4 所用引物
• 2.1.5 主要仪器及软件
• 2.1.6 主要工具酶及生物试剂
• 2.1.7 主要溶液与培养基的配置
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 KcBURP蛋白基因的克隆
• 2.2.1.1 引物设计与合成
• 2.2.1.2 改进的热硼砂法提取秋茄叶片总RNA
• 2.2.1.3 cDNA的合成
• 2.2.1.4 基因ORF区扩增
• 2.2.2 KcBURP基因的表达载体的构建
• 2.2.2.1 中间载体的构建
• 2.2.2.2 表达载体的构建
• 2.2.2.3 重组质粒的鉴定及保存
• 2.2.3 农杆菌的转化
• 2.2.3.1 感受态细胞的制备
• 2.2.3.2 植物表达载体向农杆菌感受态细胞的转化
• 2.2.3.3 阳性克隆的鉴定
• 2.2.4 农杆菌侵染烟草
• 2.2.5 转化植株的鉴定
• 2.2.5.1 基因组PCR检测
• 2.2.5.2 RT-PCR检测
• 2.2.6 转基因烟草的功能分析
• 2.3 实验结果与分析
• 2.3.1 秋茄叶片总RNA
• 2.3.2 KcBURP基因的克隆
• 2.3.2.1 KcBURP基因的克隆及基因序列分析
• 2.3.2.2 KcBURP蛋白同源性分析
• 2.3.2.3 KcBURP蛋白系统发生分析
• 2.3.2.4 KcBURP蛋白保守区的分析
• 2.3.2.5 KcBURP蛋白疏水性分析
• 2.3.2.6 KcBURP蛋白跨膜区分析
• 2.3.2.7 KcBURP蛋白信号肽预测
• 2.3.3 KcBURP基因的表达载体的构建
• 2.3.4 KcBURP基因的表达载体转化农杆菌
• 2.3.5 KcBURP基因对烟草的转化及鉴定
• 2.3.5.1 农杆菌侵染烟草
• 2.3.5.2 转化植株的鉴定
• 2.3.6 转基因烟草的功能分析
• 2.4 讨论
• 2.4.1 KcBURP基因的结构特点
• 2.4.2 KcBURP基因的耐盐性
• 3 秋茄KcC2H2型锌指蛋白克隆及遗传转化
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 质粒
• 3.1.3 菌株
• 3.1.4 所用引物
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 KcC2H2型锌指蛋白基因的克隆
• 3.2.2 KcC2H2型锌指蛋白基因的表达载体的构建
• 3.2.2.1 BP重组装入入门载体
• 3.2.2.2 LR重组装入表达载体
• 3.2.3 农杆菌的转化
• 3.2.4 农杆菌侵染烟草
• 3.2.5 转化植株的鉴定
• 3.3 实验结果与分析
• 3.3.1 KcC2H2型锌指蛋白基因的克隆
• 3.3.1.1 KcC2H2型锌指蛋白基因的克隆及基因序列分析
• 3.3.1.2 KcC2H2型锌指蛋白同源性分析
• 3.3.1.3 KcC2H2型锌指蛋白系统发生分析
• 3.3.1.4 KcC2H2型锌指蛋白疏水性分析
• 3.3.1.5 KcC2H2型锌指蛋白跨膜区分析
• 3.3.1.6 KcC2H2型锌指蛋白信号肽预测
• 3.3.2 KcC2H2型锌指蛋白基因的表达载体的构建及转化农杆菌
• 3.3.3 KcC2H2型锌指蛋白基因对烟草的转化及鉴定
• 3.3.3.1 农杆菌侵染烟草
• 3.3.3.2 转化植株的鉴定
• 3.4 讨论
• 4 结论
• 4.1 结论
• 4.2 进一步工作计划
• 参考文献
• 个人简介
• 导师简介
• 致谢