高羊茅FaChit1基因的克隆与表达调控以及一种转基因植物新型检测方法的研究

论文摘要

高羊茅是一种分布十分广泛的草坪草,主要用于草坪的建植,人们居住环境的美化。由于草坪草抗逆性较差,在生长过程中容易受致病性真菌等多种病原体的侵染。如何提高它们的抗病、抗虫、抗旱、耐盐以及耐瘠薄特性已成为一个重要的研究方向,利用转基因技术将植物几丁质酶基因等抗性基因导入草坪草基因组不失为一种有效的手段。植物几丁质酶能够通过水解真菌和昆虫围咽膜的几丁质组分,破坏细胞结构,有效提高植物对病虫害的抗性;而且有些植物几丁质酶还具有其它抗逆功能,可以增强植物对逆境的适应能力。但目前可利用的这类有利基因较少,且涉及基因专利和生物安全性评价问题。通过对草坪草品种抗逆性状的调研鉴定,发现高羊茅（Festuca arundinacea）具有抗病性强、抗旱、耐瘠薄、适应性广等优良性状,若能从高羊茅分离出Ⅰ类几丁质酶基因及其启动子序列并进行功能验定,然后运用基因工程方法将二者一起转入其它需要改良的的草坪草中,则相关草坪草的抗病及抗逆性状问题不但有望得到一定程度的解决,而且外源转移基因能在其自身胁迫诱导型启动子的控制下进行有选择的诱导表达,与一般采用组成型启动子的转化体相比,转基因植株能更好的适应逆境。本研究拟从高羊茅分离和鉴定抗病原菌性能较强的Ⅰ类几丁质酶基因及其启动子序列,为进一步深入开展抗病机理研究奠定相关的基础。首先应用兼并PCR方法从真菌激发子处理的高羊茅中获得一条保守的Ⅰ类几丁质酶基因cDNA片段,然后根据测定序列设计引物,利用cDNA末端快速扩增技术（RACE）克隆了一条具有完整开放阅读框的cDNA全长序列。序列分析结果表明,该基因cDNA全长共1172 bp,具有一个951bp的完整编码框,将其命名为FaChit1,GenBank登录号为EU837265。该cDNA编码317个氨基酸,预测的蛋白质分子量约为33.240 kDa,等电点为7.91,与大多数先前报道的其它植物的Ⅰ类几丁质酶的等电点一致。用Clustal W Program程序在蛋白质数据库里进行检索,发现FaChit1基因编码产物和其它植物的Ⅰ类几丁质酶在氨基酸序列上具有较高的同源性,包含典型的几丁质结合区、催化区以及脯氨酸、半胱氨酸富集的铰链区,但缺少定位到植物液泡所必须的的C末端延伸区靶向信号。通过比较FaChit1基因的基因组序列与cDNA序列,发现FaChit1基因没有内含子。进一步采用染色体步移技术分离了FaChit1基因上游的一段935 bp的肩动了序列。分析结果显示,该序列不仅含有保守的TATA-Box和CAAT-Box等基本的启动子元件,而且包含了多个潜在的与胁迫应答有关的顺式调控元件,如W-box、ABRE、MYB转录因子结合位点、MYC转录因子结合位点以及低温胁迫响应元件等。这些调控序列的存在表明该启动子可能是一个多胁迫诱导型启动子。Southern杂交结果表明高羊茅基因组中有2个FaChit1基因拷贝。为了证实生物信息学分析结果,本工作检测了高羊茅在真菌激发子、干旱、机械损伤以及乙烯等不同胁迫条件下FaChit1基因mRNA的积累水平。Northern杂交结果表明,FaChit1基因对真菌激发子有较强的响应,无论在根中还是在叶片中,都具有较高的FaChit1-mRNA积累水平。乙烯和干旱胁迫均能诱导FaChit1基因的表达。在乙烯处理后,根及叶片中FaChit1-mRNA积累水平几乎一致;但干旱胁迫处理后,根中的mRNA积累量要比叶片中的相对高一些。FaChit1基因对机械损伤处理的反应比较微弱,只在叶片中积累少量的mRNA。进一步构建含不同长度FaChit1启动子与GUS基因的植物表达载体,分别命名为pFaChit1P-Ⅰ、pFaChit1P-Ⅱ和pFaChit1P-Ⅲ,用于转化烟草。对不同长度启动子转基因烟草进行真菌激发子、干旱、机械损伤以及乙烯等多种胁迫处理,测定GUS活性,发现真菌激发子诱导处理后-935 bp和-651 bp-FaChit1基因启动子介导的GUS诱导表达活性为对照组的6.5及5.1倍,而-233 bp-FaChit1基因启动子介导的GUS诱导表达活性很弱。干旱胁迫后,-935 bp、-651 bp、-233 bp-FaChit1基因启动子介导的GUS诱导表达活性分别为对照组的5.4、4.75及2.25倍。用乙烯喷洒处理后,-935 bp、-651 bp、-233 bp-FaChit1基因启动子介导的GUS诱导表达活性分别为对照组的5.0、2.5及1.2倍。对于机械损伤胁迫,-935 bp、-651 bp-FaChit1基因启动子只能轻微诱导GUS表达,GUS诱导表达活性分别为对照组的2.4和2.1倍,而且-233 bp-FaChit1基因启动子不再能诱导GUS表达。以上启动子缺失分析实验表明,FaChit1基因启动子-935 bp与-233 bp之间的区域是该启动子响应真菌激发子、乙烯以及机械损伤胁迫所必须的。另外,我们设计并组装了一套新型的DNA生物传感器,用来对NPT-Ⅱ基因中特异片段进行快速的检测。在植物基因工程中,载体上的新霉素磷酸转移酶基因是迄今为止使用最广泛的筛选标记基因,因此通过对NPT-Ⅱ基因的检测即可间接确认各自所需转化的目的基因是否整合到植物宿主细胞DNA中。实验结果表明,该DNA生物传感器对NPT-Ⅱ基因中特异片段的准确检测可作为一种通用方法应用于许多转基因植物的快速鉴定。经过DNA探针设计方式的改进,该DNA生物传感器的检测特异性得到明显提高,杂交复合体在金电极表面形成的树枝状结构大大增加了其所结合的过氧化氢酶量,杂交信号得以放大数倍,DNA检测的浓度极限达到0.2×10-9mM。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略词语
• 第一部分 高羊茅FACHIT1基因的克隆及其表达调控研究
• 第一章 文献综述
• 1 植物几丁质酶的分子生物学研究进展
• 1.1 植物几丁质酶的分布定位
• 1.2 植物几丁质酶的类型及其结构特征
• 1.2.1 Ⅰ类和Ⅱ类几丁质酶
• 1.2.2 Ⅲ类几丁质酶
• 1.2.3 Ⅳ类、Ⅴ类、Ⅵ类及Ⅶ类几丁质酶
• 1.3 植物几丁质酶的功能
• 1.3.1 抗真菌活性
• 1.3.2 参与植物的发育调控
• 1.3.3 其它一些功能
• 1.4 植物几丁质酶基因的结构
• 1.5 植物几丁质酶基因的表达调控
• 1.6 植物几丁质酶的应用前景
• 1.7 本研究的目的、意义和内容
• 第二章 高羊茅FACHIT1基因cDNA的克隆及其诱导表达
• 2.1 材料和试剂
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 其它有关材料及试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 植物材料与处理
• 2.2.2 总RNA的提取
• 2.2.3 cDNA第一链的合成
• 2.2.4.高羊茅FaChitl基因cDNA保守片段的克隆
• 2.2.4.1 RT-PCR简并引物的设计
• 2.2.4.2 RT-PCR反应体系及程序
• 2.2.4.3 RT-PCR反应产物的回收
• 2.2.4.4 扩增DNA片段与载体的连接
• 2.2.4.5 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.4.6 质粒DNA的大肠杆菌转化
• 2.2.4.7 重组质粒的提取
• 2.2.4.8 重组质粒DNA的限制性酶切检测
• 2.2.4.9 扩增DNA片段的序列测定及分析
• 2.2.5.RACE扩增cDNA的3'末端
• 2.2.5.1 引物设计及原理
• 2.2.5.2 反转录反应
• 2.2.5.3 嵌套式PCR反应
• 2.2.5.3.1 Outer PCR反应
• 2.2.5.3.2 Inner PCR反应
• 2.2.5.4 PCR反应产物的回收、克隆、测序及分析
• 2.2.6 RACE扩增cDNA的5'末端
• 2.2.6.1 引物设计及原理
• 2.2.6.2 去磷酸化处理
• 2.2.6.3 去除mRNA的5'帽子结构
• 2.2.6.4 5'RACE adaptor的连接
• 2.2.6.5 反转录反应
• 2.2.6.6 嵌套式PCR反应
• 2.2.6.6.1 Outer PCR反应
• 2.2.6.6.2 Inner PCR反应
• 2.2.6.7 PCR反应产物的回收、克隆、测序及分析
• 2.2.7 RNA blotting检测FaChitl基因的表达
• 2.2.7.1 杂交探针的制备
• 2.2.7.2 Northern blotting
• 2.2.7.2.1 RNA变性凝胶电泳
• 2.2.7.2.2 碱性条件下RNA向尼龙膜的毛细管转移
• 2.2.7.2.3 杂交
• 2.2.7.2.4 杂交信号的检测
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 总RNA的提取
• 2.3.2 FaChitl基因eDNA保守片段的克隆
• 2.3.2.1 FaChitl基因cDNA保守片段的测序结果分析
• 2.3.3 高羊茅FaChitl基因cDNA全长序列的克隆
• 2.3.4 FaChitl的CDS（Conserved Domain Sequence）搜索结果
• 2.3.5 FaChitl基因核苷酸及其对应的氨基酸序列
• 2.3.6 同源性及其保守结构域分析
• 2.3.7 系统进化树
• 2.3.8 FaChitl基因的表达分析
• 2.3.8.1 FaChitl基因在根及叶片组织中对真菌激发子诱导的反应
• 2.3.8.2 FaChitl基因在根及叶片组织中对乙烯、渗透以及机械损伤等胁迫处理的表达反应
• 2.4 讨论
• 第三章 高羊茅FACHIT1基因组DNA的克隆及其拷贝数的验定
• 3.1 材料和试剂
• 3.1.1 主要试剂
• 3.1.2 其它有关材料及试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 基因组DNA的提取
• 3.2.2 FaChitl启动子序列的克隆
• TM染色体步移原理'>3.2.2.1 BD Genome Walker^TM染色体步移原理
• TM DNA文库的构建'>3.2.2.2 BD Genome Walker^TMDNA文库的构建
• TM染色体步移'>3.2.2.3 BD Genome Walker^TM染色体步移
• 3.2.2.4 PCR反应产物的回收、克隆、测序及分析
• 3.2.3 FaChitl基因组3'非翻译区（3'UTR）的克隆
• 3.2.4 FaChitl基因组序列的克隆
• 3.2.5 Southern blotting检测FaChitl基因的拷贝数
• 3.2.5.1 杂交探针的制备
• 3.2.5.2 Southern blotting检测
• 3.2.5.2.1 DNA的限制性酶切及电泳
• 3.2.5.2.2 碱性条件下DNA向尼龙膜的毛细管转移
• 3.2.5.2.3 杂交
• 3.2.5.2.4 杂交信号的检测
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 FaChitl基因启动子的克隆及序列分析
• 3.3.2 FaChitl 3'非翻译区基因组序列的克隆与分析
• 3.3.3 FaChitl基因组序列的克隆与分析
• 3.3.4 FaChitl基因的拷贝数
• 3.4 讨论
• 第四章 高羊茅FACHIT1启动子的功能分析
• 4.1 材料和试剂
• 4.1.1 主要试剂
• 4.1.2 其它有关材料及试剂
• 4.1.3 主要仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 不同长度FaChitl基因启动子与GUS基因融合植物表达载体的构建
• 4.2.2 植物表达载体的农杆菌转化
• 4.2.2.1 农杆菌感受态细胞的制备
• 4.2.2.2 冻融法转化农杆菌
• 4.2.3 农杆菌介导的烟草遗传转化
• 4.2.4 转基因烟草的PCR检测
• 4.2.5 转基因烟草的Southern杂交鉴定
• 4.2.5.1 转基因烟草的DNA提取
• 4.2.5.2 DNA的限制性酶切和电泳
• 4.2.5.3 杂交探针的制备
• 4.2.5.4 Southern杂交检测
• 4.2.6 转基因烟草的GUS荧光活性分析
• 4.2.6.1 转基因烟草的胁迫处理
• 4.2.6.2 转基因烟草的GUS荧光活性测定
• 4.2.6.2.1 新鲜转基因烟草叶片组织GUS蛋白的提取
• 4.2.6.2.2 GUS酶反应
• 4.2.6.2.3 荧光测定
• 4.2.6.2.4 GUS提取液蛋白含量测定
• 4.2.6.2.5 酶活力计算
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 不同长度的FaChitl启动子与GUS基因融合表达载体
• 4.3.2 含不同长度FaChitl启动子转基因烟草的获得及分子鉴定
• 4.3.2.1 转基因烟草的PCR鉴定
• 4.3.2.2 转基因烟草的Southern杂交鉴定
• 4.3.3 不同长度FaChitl启动子对多种胁迫的应答特征
• 4.3.3.1 不同长度FaChitl启动子对真菌激发子（Fungal elicitor）的应答特征
• 4.3.3.2 不同长度FaChitl启动子对干旱胁迫的反应
• 4.3.3.3 不同长度FaChitl基因启动子对乙烯胁迫的反应
• 4.3.3.4 不同长度FaChitl启动子对机械损伤胁迫的反应
• 4.3.4 pFaChitlP-Ⅰ转化系烟草中GUS基因的mRNA表达水平
• 4.4 讨论
• 第一部分小结
• 参考文献（REFERENCES）
• 第二部分 一个新型的DNA生物传感器在转基因植物检测上的应用研究
• 1 综述
• 1.1 检测转基因植物的常规方法
• 1.2 DNA生物传感器
• 1.2.1 光学DNA生物传感器
• 1.2.2 声波DNA生物传感器
• 1.2.3 电化学DNA生物传感器
• 1.3 电化学DNA生物传感器的应用现状
• 1.4 研究内容、目的和意义
• 2 实验和方法
• 2.1 试剂及材料
• 2.2 目标序列的PCR扩增
• 2.3 DNA生物传感器在金电极表面的组装
• 2.3.1 金电极表面的生物化修饰
• 2.3.2 金电极表面的杂交
• 2.3.3 链亲和素与信号探针的结合
• 2.3.4 过氧化氢酶的生物素化标记
• 2.3.5 生物素化标记的过氧化氢酶与链亲和素的结合
• 2.3.6 电化学信号的检测
• 3 结果与分析
• 3.1 金电极表面聚苯胺的循环伏安值
• 3.2 传感器组装中各参数的优化
• 3.2.1 捕获探针浓度的优化
• 3.2.2 信号探针浓度的优化
• 3.2.3 链亲和素浓度的优化
• 3.2.4 生物素及过氧化氢酶浓度的优化
• 3.3 生物传感器对序列检测的特异性验定
• 3.4 生物传感器对序列检测的灵敏度
• 3.5 PCR产物的Southern杂交验定
• 4 讨论
• 5 第二部分小结
• 参考文献（References）
• 攻读博士学位期间取得的研究成果
• 致谢