汉逊德巴利酵母WC43-3菌株内β-1，3-葡聚糖酶及其基因的研究

论文摘要

β-1,3-葡聚糖酶可以裂解β-葡聚糖中的β-1,3-糖苷键,广泛存在于各种真菌中,在真菌的新陈代谢和形态发生过程中行使着重要功能,并在工业生产中有巨大的潜在应用。根据β-1,3-葡聚糖酶对底物水解模式的不同,可以分为外切β-1,3-葡聚糖酶和内切β-1,3-葡聚糖酶两大类。目前多种真菌和酵母菌生产的胞外β-1,3-葡聚糖酶已被报道,而关于海洋酵母内切β-1,3-葡聚糖酶的报道较少。我们从实验室的海洋酵母菌种库中筛选出一株产胞外内切β-1,3-葡聚糖酶的菌株WC43-3。常规鉴定和分子生物学鉴定的结果表明该菌株为一株汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）。我们对海洋酵母D. hansenii WC43-3产胞外内切β-1,3-葡聚糖酶的培养条件进行了优化,得到最佳的产酶条件:培养基成分为葡萄糖5%（w/v）,蛋白胨2%（w/v）,酵母粉0.5%（w/v）,碳酸钙0.4%（w/v）,海水配制,初始pH为6.0, 28 oC,180rpm摇床振荡培养58h达到最大酶产量0.45 U/ml。我们通过层析的方法纯化了海洋酵母菌WC43-3的内切β-1,3-葡聚糖酶,它是分子量为65.0 kDa的单链蛋白,纯化的β-1,3-葡聚糖酶水解海带多糖的产物是二糖。纯化β-1,3-葡聚糖酶的最适作用温度为40 oC,在40 oC以下稳定性较好;纯化β-1,3-葡聚糖酶的最适作用pH值为5.0,在pH5.0-8.0之间较稳定。Ni2+对纯化的内切β-1,3-葡聚糖酶的活性有激活作用,而Mn2+, Ca2+, Mg2+, Co2+, Zn2+, Hg2+, Cu2+, Fe3+,和Fe2+对纯化的酶的活性有抑制作用。蛋白抑制剂1,10-菲啰啉、EGTA、PMSF、EDTA、SDS和碘乙酸对内切β-1,3-葡聚糖酶的活力均有抑制作用。海洋酵母菌株D. hansenii WC43-3菌株β-1,3-葡聚糖酶的米氏常数Km值和最大反应速率Vmax分别为2.31 mg/ml和1.65 mg/（min.ml）。我们利用简并引物PCR法扩增得到编码WC43-3菌株内切β-1,3-葡聚糖酶的基因的部分序列537bp。依据此序列利用反向PCR法扩增得到WC91-2菌株β-1,3-葡聚糖酶DhENG1基因及两侧部分基因,并推测出ORF框大小为1830bp。分析DhENG1基因序列,推测出其启动子位于-90到-135的位置,并含有一个TATA框;其终止子+1889到+1894的位置,含有序列AATAAA。根据克隆得到的DhENG1基因序列推导出β-1,3-葡聚糖酶的氨基酸序列,共609个氨基酸,前19个氨基酸为信号肽,有两个N-糖基化位点,预测分子量为65.11 kDa。DhENG1蛋白中含有糖水解酶第81族的特征序列EESTSED,其中的第二个和最后一个Glu残基可能是潜在的催化位点。为了验证WC43-3菌株的DhENG1基因确实编码内切β-1,3-葡聚糖酶,我们利用pINA1317作为表达载体,将DhENG1基因在Y. lipolytica Po1h中成功进行了表达,转化子具有内切β-1,3-葡聚糖酶活性,DhENG1基因的功能得到了验证。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 海洋中的酵母菌
• 1.1.1 海洋酵母菌的种类和分布
• 1.1.2 深海中的酵母菌
• 1.1.3 红树林中的酵母菌
• 1.1.4 海洋鱼类中的酵母
• 1.1.5 海洋酵母菌产的活性物质
• 1.2 β-1,3-葡聚糖酶概述
• 1.2.1 β-葡聚糖
• 1.2.2 β-1,3-葡聚糖酶的分类
• 1.2.3 β-1,3-葡聚糖酶的生理功能和应用
• 1.2.4 真菌β-1,3-葡聚糖酶的研究进展
• 1.3 论文的研究依据和主要的研究内容
• 第二章 产胞外内切 β-1,3-葡聚糖酶酵母菌株的筛选 和产酶条件的优化
• 2.0 前言
• 2.1 材料和方法
• 2.2 结果和讨论
• 2.2.1 产内切β-1,3-葡聚糖酶酵母菌株的筛选结果
• 2.2.2 海洋酵母菌 WC43-3 的鉴定结果
• 2.2.3 培养条件的优化
• 2.3 本章小结
• 第三章 海洋酵母 D. hansenii WC43-3 菌株内切β-1,3-葡聚糖酶的纯化和特性研究
• 3.0 前言
• 3.1 材料和方法
• 3.2 结果和讨论
• 3.2.1 海洋酵母WC43-3 菌株β-1,3-葡聚糖酶的分离纯化
• 3.2.2 β-1,3-葡聚糖酶对海带多糖水解产物的分析
• 3.2.3 温度和pH 对于β-1,3-葡聚糖酶活力的影响
• 3.2.4 不同金属离子和蛋白抑制剂对β-1,3-葡聚糖酶活性的影响
• 3.2.5 β-1,3-葡聚糖酶动力学常数的测定
• 3.3 本章小结
• 第四章 海洋酵母D. hansenii WC43-3菌株内切β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆
• 4.0 前言
• 4.1 材料和方法
• 4.2 结果和讨论
• 4.2.1 简并引物PCR 获得WC43-3 菌株内切β-1,3-葡聚糖酶的部分基因的分析
• 4.2.2 反向 PCR 克隆获得的 WC43-3 菌株 β-1,3-葡聚糖酶全部基因的分析
• 4.2.3 DhENG1 基因序列的信息学分析
• 4.2.4 从DhENG1 基因推导的内切β-1,3-葡聚糖酶蛋白的分析
• 4.2.5 基因的表达验证
• 4.3 本章小结
• 总结与创新点
• 参考文献
• 附录：英文缩写符号及其中英文名称
• 个人简历
• 发表的学术论文
• 致谢