红花水提物的抗氧化作用及ESR波谱研究

论文摘要

氧化-抗氧化平衡是机体内环境稳定的基本内涵之一,生物体内存在抗氧化系统,包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等,这些抗氧化物质不断清除产生过多的氧自由基,以保持体内自由基的动态平衡;一旦氧自由基产生超过清除,一些重要的酶的功能就会被破坏,出现氧化应激,引起细胞膜多价不饱和脂肪过氧化反应。因自由基氧化应激而损伤生物分子包括蛋白质、DNA和脂质过氧化等,涉及人类一些疾病的病因学及病理过程,神经系统,早老性痴呆症,震颤麻痹症,癫痫等疾病都有氧自由基的参与;在循环系统,动脉粥样硬化,血栓的形成,心肌缺血再灌注损伤的发病过程中氧自由基也起着重要作用;肝炎和糖尿病与氧自由基密切相关;致癌、促癌和癌的形成的每一步都有氧自由基的产生与参与;白内障的形成和视网膜的损伤是氧自由基和脂质过氧化的直接结果;在免疫反应的炎症中,巨噬细胞呼吸爆发释放大量氧自由基等。其中典型的例子是氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）氧化修饰导致的AS发生发展。ox-LDL能够诱发氧自由基的产生,生成脂过氧自由基,引发脂质过氧化的连锁反应,进而损伤内皮细胞的屏障功能,使其通透性增高,加速AS的形成;心肌缺血再灌注损伤近年来受到人们广泛的关注,其氧自由基产生过多是其发生机制之一;过氧化氢（H2O2）是机体氧化代谢产物,同时又是一种活性氧,很容易穿透细胞膜到达胞内位点,生成·OH等活性更强的自由基,引起一系列的损伤,采用过氧化氢损伤模型可模拟多种氧自由基引发疾病的病理状态。氧自由基损伤与人类的100多种疾病有直接关系,因此,预防或减少体内的氧自由基损伤,从而减少疾病的发生是人们一直期待解决的问题。本研究作为科技部国际合作项目（十一五科技计划）:抗氧化中药功效及安全性评价技术体系的建立的子课题,通过文献查阅及前期的实验研究发现,红花作为活血化瘀的常用中药,具有多方面的药理作用,在防治心血管疾病方面具有明显的优势。因此,本项研究从体内和体外两个层次,以抗氧化为切入点,采用不同的氧化病理损伤模型,观察红花水提物抗氧化作用及其机制,为红花的临床应用提供科学依据。本研究采用整体大鼠高脂血症模型、体外ox-LDL致心肌微血管内皮细胞损伤模型、心肌微血管内皮细胞缺氧再给氧损伤模型、乳鼠心肌细胞缺氧再给氧损伤模型、乳鼠心肌细胞H2O2损伤模型,观察红花水提物的抗氧化作用和作用机制,实验结果如下:1.红花水提物对高脂血症大鼠抗氧化作用的影响喂饲高脂饲料建立高脂血症大鼠模型,观察红花水提物对高脂血症大鼠的保护作用。实验共分5组:空白对照组,模型对照组,红花水提物组(4.05,2.03,0.81g生药·kg-1)剂量组,连续给药4周后,测定血清MDA,SOD和NO水平。实验结果表明:给予红花水提物三个剂量后可明显降低高脂血症大鼠血清MDA的含量,中剂量能提高血清SOD活性,提示红花水提物对高脂血症大鼠具有一定程度的抗氧化作用。2.红花水提物对ox-LDL所致心肌微血管内皮细胞损伤的影响采用第三代大鼠乳鼠心肌微血管内皮细胞,观察红花水提物预处理对ox-LDL诱导损伤的心肌微血管内皮细胞的保护作用。实验分5组,空白对照组:正常完全培养基培养;模型对照组:加入ox-LDL(100μg·mL-1)孵育24 h;红花水提物500,100,20μg·mL-1剂量组:分别加入不同浓度的红花水提物预处理24h,然后换为100μg·mL-1的ox-LDL溶液孵育24h。所有细胞均在37℃,95%O2+5%CO2,饱和湿度条件下的二氧化碳培养箱中培养。实验结束后分别收集细胞上清液测定LDH,MDA,SOD,NO,NOS,XOD和GSH-Px活性,收集细胞悬液应用电子自旋波谱仪测定活性氧自由基信号。实验结果表明:红花水提物预处理能明显提高ox-LDL损伤的内皮细胞存活率,减少LDH,MDA和XOD释放量,提高SOD,GSH-Px和NOS活性,同时使细胞悬液中的自由基信号明显减弱。结果提示红花水提物对ox-LDL损伤的心脏微血管内皮细胞具有保护作用,其机制可能与直接减少自由基生成,增强其清除以及增强内源性抗氧化酶的活性有关。3.红花水提物对心肌微血管内皮细胞和心肌细胞缺氧/复氧所致损伤的影响分别采用第三代大鼠乳鼠心肌微血管内皮细胞和原代培养的乳鼠心肌细胞,建立细胞缺氧/复氧模型,观察红花水提物预处理对血管内皮细胞和心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。实验各分5组,空白对照组:正常完全培养基培养;模型对照组:缺氧3h/复氧1h;红花水提物500,100,20μg·mL-1剂量组:分别给予不同浓度的红花水提物预处理24h后,缺氧3h/复氧1h。除缺氧外,所有细胞均在37℃,95%O2+5%CO2,饱和湿度条件下的二氧化碳培养箱中培养。实验结束后分别收集细胞上清液测定LDH,MDA,SOD,NO,NOS,XOD和GSH-Px活性,收集细胞悬液应用电子自旋波谱仪测定活性氧自由基信号。实验结果表明:红花水提物预处理能明显提高缺氧3h/复氧1h后细胞存活率,减少LDH,MDA释放,降低XOD活力,提高SOD,NO和NOS活性,同时使细胞悬液中的活性氧自由基信号明显减弱。结果提示红花水提物对心脏微血管内皮细胞和心肌细胞缺氧/复氧损伤具有保护作用,其机制可能与直接减少自由基生成,增强其清除以及增强内源性抗氧化酶的活性有关。4.红花水提物对体外培养乳鼠心肌细胞H2O2所致氧化损伤的影响采用原代培养的乳鼠心肌细胞,建立心肌细胞H2O2氧化损伤模型,观察红花水提物预处理对心肌细胞H2O2氧化损伤的保护作用。实验分5组,空白对照组:正常普通培养基培养;模型对照组:换为H2O2(1mmol·L-1),孵育1h;红花水提物500,100,20μg·mL-1剂量组:分别给予不同浓度的红花水提物,预处理24h,然后换为H2O2(1mmol·L-1)孵育1h。所有细胞均在37℃,95%O2+5%CO2,饱和湿度条件下的二氧化碳培养箱中培养。实验结束后分别收集细胞上清液测定LDH,MDA,SOD,NO,NOS,XOD和GSH-Px活性,收集细胞悬液应用电子自旋波谱仪测定活性氧自由基信号。实验结果表明:红花水提物三个剂量组预处理能明显提高H2O2氧化损伤的心肌细胞存活率,减少LDH,MDA和XOD含量,提高SOD,GSH-Px和NO活性,同时有使细胞悬液中的自由基信号减弱的趋势。结果提示红花水提物对心肌细胞H2O2氧化损伤具有保护作用,其机制可能与直接减少自由基生成,增强其清除以及增强内源性抗氧化酶的活性有关。综上,红花水提物预处理不仅在整体动物模型,对高脂血症大鼠具有一定的抗氧化作用,在体外培养的微血管内皮细胞ox-LDL损伤模型、内皮细胞缺氧再给氧模型、体外培养的心肌细胞缺氧再给氧模型、心肌细胞H2O2损伤模型四个模型上,均可提高细胞上清液中的SOD,GSH-Px,NO和NOS活性,降低LDH,MDA和XOD的含量,通过ESR检测,发现还可直接减少自由基的产生,增强其清除而达到抗氧化的作用。结果提示红花水提物具有抗氧化作用,其机制与减少自由基生成,增强其清除,增强内源性抗氧化酶的活性,使高毒性的自由基转化成无害物质,减少氧化产物生成等有关。

论文目录

• 目录
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 英文缩写附录
• 实验设计示意图
• 文献综述
• 氧化应激与心血管疾病的关系
• 1 概述
• 2 氧化应激与心血管疾病
• 3 ROS的相关信号调节
• 4 中医药防治心血管疾病的研究
• 前言
• 实验研究
• 第一章 红花水提物对高脂血症大鼠抗氧化作用的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第二章 红花水提物对OX-LDL所致心肌微血管内皮细胞损伤的影响
• 1 大鼠乳鼠心肌微血管内皮细胞原代培养方法的建立
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 2 氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）造模浓度的确定
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 3 红花水提物对ox-LDL损伤的心肌微血管内皮细胞的影响
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 4 红花水提物对ox-LDL损伤的心肌微血管内皮细胞中自由基信号的影响
• 4.1 材料
• 4.2 方法
• 4.3 结果
• 4.4 讨论
• 第三章 红花水提物对心肌微血管内皮细胞和心肌细胞缺氧/复氧所致损伤的影响
• 1 大鼠乳鼠心肌微血管内皮细胞原代培养方法的建立
• 2 大鼠乳鼠心肌细胞原代培养方法的建立
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 3 红花水提物对缺氧/复氧损伤的内皮细胞和心肌细胞的影响
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 4 红花水提物对缺氧/复氧损伤心肌微血管内皮细胞和心肌细胞中自由基信号的影响
• 4.1 材料
• 4.2 方法
• 4.3 结果
• 4.4 讨论
• 2O₂所致氧化损伤的影响'>第四章 红花水提物对体外培养乳鼠心肌细胞H₂O₂所致氧化损伤的影响
• 1 大鼠乳鼠心肌细胞原代培养方法的建立
• 2O₂）造模浓度及时间的确定'>2 过氧化氢（H₂O₂）造模浓度及时间的确定
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 2O₂氧化损伤的影响'>3 红花水提物对心肌细胞H₂O₂氧化损伤的影响
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 2O₂致心肌细胞损伤后自由基信号的影响'>4 红花水提物对H₂O₂致心肌细胞损伤后自由基信号的影响
• 4.1 材料
• 4.2 方法
• 4.3 结果
• 4.4 讨论
• 结论
• 文献综述参考文献
• 实验研究参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 附图